Premières expériences du diagnostic des formes héréditaires de

yokeenchantingBiotechnology

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16/12/2011
Deauville
Dominique VAUR, Plateforme SéSAME
CLCC François Baclesse, Caen
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Contexte
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Deauville
Risque cumulé de cancer à 70 ans
Cancer du
sein
Cancer de
l’ovaire
Femmes porteuses d’une mutation de BRCA1
60%40%
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CLCC François Baclesse, Caen
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Femmes porteuses d’une mutation de BRCA2
40%10%
Population générale10%1%
Antoniou et al.Am.J.Hum.Genet. 72,2003 :1117-1130
16/12/2011
Deauville
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MP : Mutations Ponctuelles
RGT : Réarrangements de grande taille
16/12/2011
Deauville16 décembre 2011
Deauville
Comment augmenter le nombre de
mutations identifiées ?
16/12/2011
Deauville
Remaniements génomiques
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Bruno Zeitouni, BIOINFORMATICS APPLICATIONS NOTE Vol. 26 no. 15 2010, pages 18951896
RuibinXi, BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS. VOL 9. NO 5. 405^ 415
16/12/2011
Deauville
Autres gènes
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William D. Foulkes, N Engl J Med 2008;359:2143-53.
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Le projet CASO V1
Run 1 : 12 échantillons connus mutés pour BRCA1/2
multiplexage avant/après capture-par 6 ou 12
Run 2 : validation sur 48 échantillons supplémentaires
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Run 2 : validation sur 48 échantillons supplémentaires
Run 3 : run de validation en aveugle
Outils bioinformatiques (analyse de BRCA1et 2)
CASAVA 1.8 GenomeStudio®(Illumina)
Genomics (CLCbio)
NextGENe(Softgenetics)
CNV-seq
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CASO V1: gènes capturés
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CASO V1
Sample prep
Capture
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Capture
SureSelect
(Agilent Technologies)
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DNA
Barcode
Primer
CASO V1 : Sampleprep
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Adaptateur
Barcode
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DNA
Barcode
CASO V1 : Sampleprep
Primer de
séquençage
Primer de
séquençage
Séquençage paired-end 2x76 pb
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Barcode
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CASO V1 -Run 1 12 échantillons
GèneExon/IntronHGVS c.Index
BRCA1Del 1-24c.1-?_5592+?delCAACCT
BRCA1Dup 5-7c.135-?_441+?dupAACCAT
BRCA1Ex 11c.2612_2613insTAATTAT
BRCA1Dup 13c.4186-?_4357+?dupACACAT
BRCA1
Ex 13
c.4282ins39
GCATGT
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BRCA1
Ex 13
c.4282ins39
GCATGT
BRCA1Ex 18c.5077_5082del6ins12CCCCCT
BRCA2Ex 9c.736_755del20TCGATT
BRCA2Ex 10c.1231del11ins4CGATCT
BRCA2Ex 12c.6848C>ATGCATT
BRCA2Ex 14c.7069_7070delCTAGCTAT
BRCA2Ex 23c.9097dupAGGTTGT
BRCA1Ex 11c.1175_1214del40AAGGAT
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Deauville
16/12/2011
Deauville
CASO V1 -Run 1 : résultats
Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4
Nb
déchantillons
121266
Nb reads
(millions)
68.060.454.061.0
On/off target
(CASAVA)
14%17%16%18%
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(CASAVA)
On/off target
(NextGENe)
29%35%34%37%
Couverture
(on target)
314186107
Couverture
(exons)
354798123
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CASO V1 -Run 1 : résultats
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BP : break point
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CASO V1 -Run 1 : résultats
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GèneRéarrangements de grande taille
BRCA1c.1-?_80+?del (del exon 2)
BRCA1
c.671-?_4185+?del (del exon 11-12)
BRCA1
c.81-?_134+?del (del exon 3)
BRCA1
c.442-?_4357+?del (del exon8-13)
BRCA1
c.81-?_4986+?del (del exon3-16)
BRCA1
c.442-?_4357+?del (del exon8-13)
BRCA1
c.135
-
?_5592+?del (del
exon
5
-
24)
15 RGT
(13 BRCA1, 2BRCA2)
16/12/2011
Deauville
CASO V1 -Run 2
GèneInsertions/délétions
BRCA1
c.3481_3491 del11
BRCA1c.3947_3950delTCTT
BRCA1c.5277+48_59dup12
BRCA1c.3731_3738del8
BRCA1c.5332+182dupA
BRCA1
c.282_288dupGCTTGAC
14 indels dans BRCA1
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Deauville
CASO V1 -Run 2
GèneInsertions/délétions
BRCA2
c.9435_9436delGT
BRCA2c.5272_5274delAAT
BRCA2c.7795_7797delGAA
BRCA2c.681+97_681+98delGT
BRCA2c.1389_1390delAG
BRCA2c.8053delA
BRCA2
c.1796_1800del5
14 indels dans BRCA2
16/12/2011
Deauville
CASO V1 -Run 2
GèneVariation
génomique
Variation
protéique
BRCA1
c.213-1G>AP.?
BRCA1
c.3979C>Tp.Gln1327X
BRCA2
c.516+2T>C
P.?
9 mutations ponctuelles
dans BRCA1 et 2
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BRCA2
c.516+2T>C
P.?
BRCA2c.7007G>AP.?
BRCA2c.1395A>Cp.(=)
BRCA2c.6848C>Ap.Pro2283His
BRCA2c.7558C>Tp.Arg2520X
BRCA2c.8707G>Tp.Glu2903X
BRCA2c.273C>Ap.Tyr91X
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Deauville
CASO V1 -Run 2 : résultats
Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Lane 7Lane 8
Nb
déchantillons
66666666
Nb reads
(millions)
84.5100.092.890.388.993.791.079.5
On/off target
(CASAVA)
44%
42%
42%
44%
42%
42%
41%
39%
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(CASAVA)
44%
42%
42%
44%
42%
42%
41%
39%
On/off target
(NextGENe)
83%80%79%83%81%82%76%74%
Couverture
(on target)
252181205226242263204228
Couverture
(exons)
285205232256274297231256
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Run 2 -résultats : sensibilité
Type de mutationAttendusObservésSensibilité
RGT*
1515*100%
Indels
2828100%
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Mutations
ponctuelles
99100%
(*) c.156_157insAlu de 350 pb dans lexon 3 de BRCA2
nest pas mise en évidence par CNVSeq mais CASAVA
montre un point de cassure et NextGENe une suite de
mutations ponctuelles
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Deauville
Run 2 -résultats : spécificité
NextGENe®Non filtré (Exons +/-50 pb)Filtré (Exons +/-50 pb)
Type de mutation
Observés
Attendus
Observés
Attendus
Type de
mutation
ObservésAttendusSpécificité
RGT
191591%
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Type de mutation
Observés
Attendus
Observés
Attendus
Indels
et
Mutations ponctuelles
687429437429
Données filtrées :
Score ≥7,0 (score des variations contiguës s'additionnent) ,
% allèle muté ≥ 20%
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BRCA2 c.8707G>T
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BRCA2 c.156_157insAlu (350 pb)
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BRCA2 c.156_157insAlu
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Deauville
Le projet CASO V1 -Run 3
BRCA1 : c.1175_1214del40
BRCA1 : c.4987-?_5074+?del (del exon 17)
BRCA1 : c.4176
-
?_4357+?dup (dup exon 13)
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BRCA1 : c.4176
-
?_4357+?dup (dup exon 13)
BRCA1 : c.5333+?_5406+?del (del exon 22)
BRCA1 : c.4282ins39
BRCA1 : c.1232delTACCCCTATTGinsACAT
BRCA2 : c.156_157insALu
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Conclusion
16/12/2011
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Conclusion (problèmes en
suspend)
Filtrage des données
Analyses des variants
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