On-line and Real-time Fluorescence Monitoring

nuthookransomBiotechnology

Dec 10, 2012 (4 years and 6 months ago)

431 views

Αρχές Μεθόδων Μοριακής
Βιολογίας

Βουλιάνα Βελετζά,

Αναπλ. Καθηγήτρια Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής ΔΠΘ


Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης
της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια
σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε
όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και
ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα
κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο
κ.λ.π.


Αλυσιδωτή Αντίδραση
Πολυμεράσης

(PCR)


Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι
μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού
αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών
αλληλουχιών
DNA



λογαριθμική αύξηση


Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του
DNA



α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και
να επανενώνονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία
και


β) να αντιγράφονται


Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

Εφαρμογές
PCR


Ανίχνευση
DNA

και

RNA

με τεράστια
ευαισθησία


ανίχνευση ιών κ.α.
μικροοργανισμών σε πολύ μικρές
συγκεντρώσεις


Ανίχνευση μεταλλάξεων


Κάθε τμήμα του
DNA

περιέχει δεδομένο
αριθμό θέσεων περιορισμού που
μπορεί να προσβληθούν από τα
περιοριστικά ένζυμα


Τμήματα
DNA

που έχουν τις ίδιες
περιοριστικές θέσεις είναι ίδια ή
ομόλογα


Sequence digested
with: EcoNI

380bp

700bp


Sequence digested
with: AciI, BfaI

350bp

73
0bp

Ανεύρεση πρωτοταγούς δομής
DNA


Sanger
ενζυμική μέθοδος


ddntp

dntp

Παραλλαγές PCR



RT
-

PCR

(
reverse transcription PCR
)
:


για ενίσχυση RNA


Multiplex PCR


Nested PCR


Rep
-
PCR


AFPL assay


RAPD


Real Time PCR


επιτρέπει:


-

π
οσοτική εκτίμηση ανατύπων σε αρχικό διάλυμα και



-

ποσοτικοποίηση διαφορών στην έκφραση
mRNA

Multiplex PCR
-

ταυτόχρονη
ενίσχυση πολλαπλών στόχων

Primer A/F
-
PrimerA/R

Primer B/F
-
Primer B/R

Nested PCR




A’ Pcr
-
736 bp


35
κύκλοι

Nested Pcr
-
593 bp

35 κύκλοι






M.tubercolosis

RT
-
PCR
.

Συνδυασμός της αντίστροφης
μεταγραφής και της
PCR



Το αρχικό υλικό είναι mRNA.


Χρησιµοποιείται για την παραγωγή
αντιγράφων cDNA από mRNA.


Στο πρώτο βήµα χρησιµοποιείται
ανάστροφη µεταγραφάση (σύνθεση
πρώτου κλώνου)


Στο δεύτερο βήµα γίνεται σύνθεση του
δεύτερου κλώνου.


RT
-
PCR





Κατασκευή βιβλιοθηκών cDNA(κυρίως όταν
το αρχικό υλικό είναι πολύ σπάνιο)

•Ανίχνευση µεταλλάξεων χωρίς κλωνοποίηση
του γονιδίου

•Ποσοτική µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης


AFPL assay

amplified fragment length
polymorphism


Ενίσχυση περιοχής Χ με την
PCR


Πέψη με ενδονουκλεάσεις
περιορισμού


Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης



RAPD



Τυχαίοι
primers


9
-
10 βάσεις


Χαμηλή θερμοκρασία
προσκόλλησης



Ο αριθμός και η θέση των τυχαίων περιοχών ενίσχυσης
ποικίλουν σε διαφορετικά στελέχη του ίδιου

είδους

PFGE


Καλλιέργεια του μικροβίου στο ζωμό


Πέψη του γονιδιώματος με σπάνιες
ενδονουκλεάσεις περιορισμού


Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό
πεδίο

-

Real Time PCR


Είναι η διαδικασία ενίσχυσης μιας
DNA
αλληλουχίας με τη μέθοδο της
PCR

και
ταυτόχρονα της ανίχνευσης του
παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό
χρόνο καθ’

όλη τη διάρκεια της αντίδρασης
(
Real
-
time PCR).


Βασικά στοιχεία για την εκτέλεση
της
Real
-
time PCR



Ειδικές χρωστικές που ενσωματώνονται στο προϊόν της
αντίδρασης και εκπέμπουν φθορίζον
σήμα που
ανιχνεύεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης
.


Ειδικά σχεδιασμένοι υποδοχείς δειγμάτων (τριχοειδή
σωληνάρια) με άριστες οπτικές ιδιότητες για:

1.

τη διεξαγωγή της αντίδρασης

2.

και την ανίχνευση του εκπεμπόμενου σήματος

Ταυτόχρονη ανίχνευση και ανάλυση

των σημάτων φθορισμού από κάθε δείγμα.


Κινητική της αντίδρασης της
PCR

SYBR Green l



SYBR Green
I

Αποδιάταξη

Επανασύνδεση

Επιμήκυνση

Τέλος επιμήκυνσης


Σεσημασμένοι ανιχνευτές
υβριδισμού

(
Hybridization Probes
)




αποδιάταξη

επανασύνδεση

επιμήκυνση

τέλος επιμήκυνσης

LC
-
640

Real
-
time PCR



Υψηλή ταχύτητα εκτέλεσης της
PCR


Παρακολούθηση της αντίδρασης σε
πραγματικό χρόνο (
On
-
line and Real
-
time
Fluorescence Monitoring
)



Άμεσος χαρακτηρισμός προϊόντων με
την ανάλυση του σημείου τήξης τους
(
Melting Curve Analysis
)


Ταχεία και ακριβής ποσοτικοποίηση



Ελαχιστοποίηση κινδύνων επιμόλυνσης


Παρακολούθηση της
PCR
με τη χρήση

SYBR Green I




Ανάλυση

Quantification

Melting Curve

Template: human genomic DNA; Target:
β
-
Globin; Detection Format: SYBR Green I

Real
Time
PCR



Μέχρι πριν λίγα χρόνια οι Βιολόγοι
μελετούσαν τα γονίδια και τις πρωτεΐνες
κάθε ένα ξεχωριστά.


Στα γονίδια έγινε:



Χαρτογράφηση



Κλωνοποίηση &
PCR



Μεταλλαξογένεση



Αλληλουχοποίηση



Ανάλυση των πρωτεϊνών που

κωδικοποιούν


Έτσι μελετήθηκαν πολλά γονίδια


Πρόγραμμα ανθρώπινου γονιδιώματος


30.000 γονίδια


Γονιδιώματα άλλων οργανισμών (
E.coli
,
Drosophila,
ποντικού κ.λ.π.)


Για να γίνει εφικτή η εύρεση της αλληλουχίας
νουκλεοτιδίων ολόκληρων γονιδιωμάτων
επιστρατεύθηκαν αυτοματοποιημένοι
μηχανισμοί



Humans
,
Homo sapiens
; see
Human
genome project



Neanderthal
, "
Homo neanderthalensis
"
(partial)


Haemophilus influenzae
, a bacterium
(the first free
-
living organism to have
its genome fully sequenced)


Common House Mouse
,
Mus
musculus



Brown Rat
,
Rattus norvegicus



Common Chimpanzee

Pan
troglodytes
; see
Chimpanzee Genome
Project



Rhesus Macaque
,
Macaca mulatta



Domestic
Chicken
,
Gallus gallus



Tammar Wallaby
,
Macropus eugenii



Domestic
Cat
,
Felis silvestris



Domestic
Dog
,
Canis lupus familiaris



Common fruit fly,
Drosophila
melanogaster



Baker's yeast,
Saccharomyces
cerevisiae



Red bread mold,
Neurospora crassa



Thale Cress,
Arabidopsis thaliana



Rice
,
Oryza sativa



Common
Wheat
,
Triticum aestivum



Maize
,
Zea mays



Poplar
,
Populus trichocarpa

(The first
tree to have its genome fully
sequenced)


Escherichia coli
, a coliform bacterium


SARS virus



Purple
-
spined sea urchin
,
Arbacia
punctulata



Caenorhabditis elegans
, a
nematode

worm


Zebra Danio
,
Brachydanio rerio



African clawed frog
,
Xenopus laevis



Oryzias latipes
, a medakafish


Tiger blowfish,
Takifugu rubipres



Tomato

Solanum lycopersicum



Potato

Solanum tuberosum



Western Honey bee,
Apis mellifera



Grapevine
,
Vitis vinifera L.



Spanish flu





Επιθυμητή η:


-

ταυτόχρονη μελέτη ΠΟΛΛΩΝ γονιδίων


-

ταυτόχρονη μελέτη ΟΛΩΝ των γονιδίων
ενός οργανισμού


Genomics


Συστηματική μελέτη του συνόλου του
γενετικού υλικού ενός οργανισμού


(δομή και λειτουργία)


Εξετάζονται οι μοριακοί μηχανισμοί και η
αλληλεπίδραση των γενετικών και
περιβαλλοντικών παραμέτρων στις
ασθένειες


Αν και κάθε κύτταρο ενός οργανισμού
φέρει το ίδιο
DNA…


Διαφορετικά γονίδια εκφράζονται σε κάθε
διαφορετικό ιστό




διαφορετικά

RNA


Ποιοτική και ποσοτική διαφορά


Συγκρίνοντας το προφίλ γονιδιακής
έκφρασης διαφορετικών κυττάρων
μπορούμε να διακρίνουμε κατά πόσον
αυτά διαφέρουν μεταξύ τους

7. dna array.exe
Μικροσυστοιχίες
(microarrays)



Υπόστρωμα:


μεμβράνη ή γυαλί


Προσδεδεμένα:
ολιγονουκλεοτίδια ή
cDNA


Προστιθέμενο:

cDNA
μάρτυρα


+


cDNA
δείγματος



Κάθε μικροσυστοιχία αποτελείται από χιλιάδες
spots
.


Κάθε
spot

περιέχει πολλαπλά αντίγραφα μιας
μοναδικής αλληλουχίας
DNA

που αντιστοιχεί σε
ένα γονίδιο (1
spot



1 γονίδιο)


Αν οι ανιχνευτές είναι
cDNA
:
Ανάλυση της
γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες
cDNA


Μπορούμε να εντοπίσουμε διαφορές μεταξύ δύο
ειδών κυττάρων, π.χ. καρκινικών κυττάρων
vs.
υγιών κυττάρων

Ανάλυση

μικροσυστοιχιών



Με τις μικροσυστοιχίες μπορούμε να
εντοπίσουμε ποια γονίδια εκφράζονται
διαφορετικά σε δύο είδη κυττάρων


Δεν μπορούμε να εντοπίσουμε ποια γονίδια
φέρουν μετάλλαξη η τι είδους βλάβη έχουν

Αριθμός αναφορών σε
μικροσυστοιχίες
DNA


SNPs

(Single

Nucleotide


Polymorphisms)

HapMap


Παγκόσμιος οργανισμός με στόχο τη δημιουργία
χάρτη που θα αντιπροσωπεύει τη
διαφορετικότητα των ανθρωπίνων απλοτύπων.


Ο χάρτης θα περιγράφει τις πλέον συνήθεις
γενετικές παραλλαγές στο ανθρώπινο
γονιδίωμα.


Συνεργασία ερευνητών σε Πανεπιστήμια, μη
κερδοσκοπικούς οργανισμούς και εταιρείες από
Καναδά, Κίνα, Ιαπωνία, Νιγηρία, Μ.Βρεττανία
και ΗΠΑ.


Proteomics


Συστηματική μελέτη του συνόλου των
πρωτεϊνών που παράγονται από ένα
γονιδίωμα


Ταυτοποίηση πρωτεϊνών και
προσδιορισμός του ρόλου τους σε
φυσιολογικές και σε παθοφυσιολογικές
καταστάσεις


Στόχοι Πρωτεωμικής


Ανάπτυξη προηγμένης αντικαρκινικής
θεραπείας


Πρόγνωση της αποτελεσματικότητας
εφαρμοζομένων θεραπειών


Ανάπτυξη εξατομικευμένης θεραπείας


Εργαλεία πρωτεωμικής


high
-
resolution
mass spectrometry

(MS):
διαχωρίζει μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών και
πεπτιδίων ανάλογα με το μοριακό βάρος
και το ηλεκτρικό φορτίο τους


Μικροσκόπια με ικανότητα μικροχειρισμών
και με τεχνολογία laser, παρέχουν τη
δυνατότητα μελέτης του συνόλου των
πρωτεϊνών
ενός

μοναδικού κυττάρου



…..
omics


Λειτουργική Γονιδιωματική

(Functional
genomics): χαρακτηρισμός των γονιδίων, των
mRNA και των αντίστοιχων πρωτεϊνών


Δομική Γονιδιωματική

(Structural genomics):
μελέτη των δομικών στοιχείων των γονιδίων και
των χρωμοσωμάτων


Συγκριτική Γονιδιωματική:

Comparative
genomics:
--

the evolutionary relationships
between the genes and proteins of different
species.