Beyond the Knockout Mouse: New Opportunities for Genetic ...


Dec 11, 2012 (4 years and 6 months ago)


Beyond  the  Knockout  Mouse:  New  Opportunities  for 
Genetic Engineering in Animals 
Sean Sanders:  Hello  and  welcome  to  the  Science/AAAS  webinar.  My  name  is  Sean 
Sanders and I’m the commercial editor and webinar editor at Science. 
Slide 1 
  So  to  begin  the  webinar.  Today,  we’re  venturing  beyond  the  knockout 
mouse  into  the  brave  new  world  of  alternative  genetically  engineered 
animal  models.  Until  recently,  transgenic  and  knockout  models  for 
disease  have  been  limited  almost  exclusively  to  mice.  Although  useful, 
these  models  have  not  always  accurately  reflected  the  physiology  and 
pathology  of  human  disease.  Now,  advances  in  genetic  engineering 
technology  have  extended  the  spectrum  of  species  available  beyond 
mice,  enabling  the  creation  of  targeted  knockouts  and  knock‐ins  in  rats, 
rabbits,  and  zebrafish,  with  the  prospect  of  achieving  precise  gene 
targeting  in  larger  animals,  including  livestock  and  nonhuman  primates. 
This  is  giving  researchers  an  unprecedented  opportunity  to  choose  the 
model  system  that  will  best  reflect  the  biology  or  human  disease  state 
that they are studying. 
  Today,  we  will  discuss  current  state‐of‐the‐art  genetic  engineering 
technologies  as  well  as  looking  at  the  future  direction  of  transgenic 
animal research beyond the knockout mouse. 
  It  gives  me  great  pleasure  to  introduce  our  three  expert  guides  for  this 
journey  today:  Dr.  Carl  Lupica  from  the  National  Institutes  of  Health  in 
Baltimore, Maryland, Dr. Rosalba Sacca from Pfizer’s Groton, Connecticut 
Campus,  and  finally  Dr.  Kerry  Ressler  from  Emory  University  in  Atlanta, 
  Many thanks to you all for being here today. Each of our speakers is going 
to  give  a  short  presentation  after  which  we  will  have  a  Q&A  session, 
during which the panel will address questions submitted by you, the live 
studio  audience.  A  reminder  to  our  online  viewers  that  you  can  see  an 
enlarged version of the slides by clicking the enlarge slides button located 
underneath  the  slide  window  of  your  web  console.  You  can  also 
download a PDF copy of the slides by using the download slides button. 
  As I mentioned, if you’re joining us live, you can submit questions to the 
panel  at  any  time  by  typing  them  into  the  ask‐a‐question  box  on  the 
bottom  left  of  your  viewing  console  and  clicking  the  submit  button. 
Please  remember  to  keep  your  questions  as  concise  as  possible  as  this 

will give them the best chance of being put to the panel. We’ll get to as 
many  questions  as  possible  in  the  Q&A  session  following  the 
  Finally,  thank  you  to  Sigma  Advanced  Genetic  Engineering  Labs  for  their 
sponsorship of today’s webinar. 
  Now,  I’d  like  to  introduce  our  first  speaker  for  this  webinar,  Dr.  Carl 
Lupica,  Dr.  Lupica  is  a  Senior  Investigator  and  Chief  of  the 
Electrophysiology Research Section in the Cellular Neurobiology Research 
Branch  at  the  National  Institute  on  Drug  Abuse  Intramural  Research 
Program at the National Institutes of Health. Prior to his current position, 
Dr.  Lupica  held  academic  positions  at  the  University  of  Arizona  Medical 
School  and  the  University  of  Colorado  Medical  School.  Dr.  Lupica’s 
current  research  focus  is  determining  the  acute  mechanisms  through 
which abused drugs alter neuronal activity in the brain and the long‐term 
adaptations  that  occur  within  brain  circuits  resulting  from  prolonged 
exposure  to  abused  drugs.  He  makes  extensive  use  of  genetically 
modified  animals  in  order  to  conclusively  identify  the  molecular  sites  of 
drug interaction. 
  Dr. Lupica, welcome. 
Dr. Carl Lupica:  Thank you. Thank you for having me here today. 
Slide 2 
  I’d like to begin by just discussing some of the models that’s we’ve used 
in  my  research,  and  use  them  as  an  example  of  the  types  of  genetically 
engineered animals that are in use today. 
Slide 3 
  The first type of model that we’ve used extensively, and in fact has been 
used extensively by researchers all over the world, is the global knockout 
mouse  in  which  a  single  protein  is  deleted  from  a  genome.  Now,  these 
animals  have  been  instrumental  in  investigating  the  roles  of  missing 
protein  targets  and  have  been  particularly  important  in  fields  of 
behavioral  pharmacology,  especially  when  pharmacological  agents  such 
as  good  antagonists  are  not  available.  Now,  these  animals  in  these 
models have had a variety of problems. And a lot of these problems have 
arisen  from issues  regarding  compensatory  changes  that  occur  since  the 
gene  responsible  for  coding  the  protein  is  knocked  out  very  early  in  the 
animal’s development. 
  Now, this is an acute problem for those of us studying the effects of gene 
knockouts in the central nervous system because the brain is very plastic, 
and there are redundant neural systems that can compensate for the loss 

of this protein. In addition to these problems, there have been identified 
a  number  of  background  strain  interactions  with  certain  protein  target 
knockouts.  One  of  which  I’ve  highlighted  in  my  slides  is  the  cannabinoid 
CB1  receptor  knockout  that  I’ve  used  in  my  own  research,  which  has 
been  done against  the background  strain  of  C57BL6  mice  and  also  Swiss 
CD1 mice. 
  Now,  when  the  CB1  receptor  is  knocked  out  in  the  C57  mice,  these 
animals  demonstrate  diminished  hippocampal  dependent  learning. 
However,  in  the  CD1  mice  when  this  receptor  is  knocked  out,  these 
animals  demonstrate  enhanced  learning.  So,  this  is  the  problem  of 
knockout of this particular gene superimposed on the particular strain of 
mouse. And this needs to be kept in mind whenever using these types of 
  Now,  conditional  knockouts  had  been  developed  to  address  some  of 
these  issues.  And  the  primary  advantage  of  the  conditional  knockout  is 
that  the  timing  of  the  knockout  can  be  closely  controlled  and  this  can 
thereby limit the amount of time for the compensation to occur. So, this 
has been advantageous. 
Slide 4 
  An example of a single gene knockout in my pharmacological research is 
shown in this slide. In this case, we’re measuring synaptic transmission in 
the  hippocampus  and  we’ve  utilized  animals  ‐‐  in  this  particular  case, 
C57BL6 mice, containing knockout of the adenosine A
 receptor and this 
is a global knockout. And under normal conditions, cannabinoid receptor 
agonists  have  very  little  effect  on  synaptic  transmission  in  the 
hippocampus, but once the A1 receptor is knocked out, we see significant 
cannabinoid  signaling.  So,  it’s  through  the  use  of  this  particular 
genetically  modified  animal  that  we’ve  been  able  to  determine  that 
there’s  an  interaction  between  cannabinoid  CB1  receptors  and  A1 
receptors in the mouse hippocampus. 
Slide 5 
  Now,  we  also  utilized  a  number  of  other  genetically  engineered  animals 
in  my  research  and  these  are  typically  promoter‐driven  knockouts, 
overexpressing  proteins,  or  the  promoter‐driven  transgene  expression. 
And these types of transgenic animals are useful for targeting a knockout 
to  specific  neuronal  populations  where  a  promoter  is  found  in  a 
particular type of cell. It is especially useful in the central nervous system. 
In  addition,  this  approach  can  be  used  for  overexpressing  genes  to  a 
specific  target  neuronal  population.  And  of  particular  interest  to  my 
work,  you  can  utilize  this  approach  to  express  reporter  proteins  to 

identify  certain  neuronal  populations  that  are  activated  during  various 
behavioral analyses. 
  And  the  examples  I’ll  use  today  are  the  expression  of  green  fluorescent 
protein  in  drug‐activated  neuronal  populations  that  are  driven  by  the 
immediate  early  gene  C‐fos  and  its  promoter.  In  addition,  I’ll  talk  a  little 
bit  about  the  deletion  of  the  mitochondrial  Tfam  gene  directed 
specifically  to  dopamine  neurons  being  driven  by  the  dopamine 
transporter promoter. 
Slide 6 
  So,  in  the  C‐fos  driven  GFP  expression  transgenic  animals,  neuronal 
activation  can  activate  C‐fos,  which  is  an  immediate  early  gene.  And 
transgenic animals have been developed in which the C‐fos promoter can 
then  activate  green  fluorescent  protein  expression  in  the  particular 
neurons  that  have  been  activated.  And  this  is  shown  in  the  bottom  left 
corner of the slide in which we have taken mice that have been exposed 
to  cocaine.  And  when  this  occurs,  we  get  activation  of  a  certain 
population or an ensemble of neurons in the nucleus accumbens of these 
mice.  We  can  then  identify  those  neurons  through  the  use  of  confocal 
microscopy  to  find  GFP  labeled  cells  and  then  perform 
electrophysiological  recordings  on  these  cells  using  modern  patch  clamp 
techniques and light microscopy. 
  In  the  bottom  right  corner  of  the  slide,  you  can  see  that  we  then  filled 
these cells with Alexa Flour 568 in order to subsequently match the cells 
up with the green fluorescent protein labeled cells that we have done the 
electrophysiological recording from. 
  So,  this  is  an  advantage  of  this  particular  transgenic  model  in  which  we 
can  look  at  neuron  populations  that  had  been  activated  by  a  particular 
stimulus, and subsequently record from those relevant neurons. 
Slide 7 
  So,  this  summarizes  some  of  the  advantages  of  this  approach.  As  I’ve 
mentioned, we can identify specific neurons that are activated by abused 
drugs  or  other  environmental  stimuli.  And  this  also  allows  us  to  identify 
neuronal  networks  that  are  involved  in  mediating  these  drug‐induced 
behaviors. We can then utilize these neurons that had been activated to 
examine  the  physiological  and  biochemical  changes  in  these  highly 
relevant neuronal populations. 
Slide 8 
  Now,  some  of  the  drawbacks  of  this  particular  approach  are  that  C‐fos 
itself  has  a  very  limited  temporal  expression  window,  and  also  GFP 
because  it’s  linked  to  C‐fos  promoter  expression.  And  therefore  the 
experiments  have  to  be  conducted  relatively  quickly  after  inducing  the 

expression  of  C‐fos.  And  this  sometimes  a  problem  and  a  longer  lasting 
signal  would  be  a  very  useful  thing  in  this  particular  approach.  In 
addition,  many  of  the  issues  that  we’ll  talk  about  today  with  regards  to 
the  relevance  of  mouse  models  to  neuroscience  research  are  derived 
from the fact much of this research has been based in the past upon the 
rat as a model organism and not on the mouse. And, therefore, there’s a 
replication of some of this work that is necessary in these modern mouse 
models. In addition, these models are, of course, not as relevant as they 
might be if they were conducted in nonhuman primate species. 
Slide 9 
  The  last  transgenic  model  that  I’ll  talk  about  that  is  being  utilized  in  my 
lab is the use of the dopamine transporter promoter to drive the deletion 
of  the  mitochondrial  transcription  factor  A  or  Tfam  gene  in  mice.  And 
Tfam  is  an  important  mitochondrial  gene  product  because  it  controls 
mitochondrial  gene  replication.  And  when  we  utilize  these  transgenic 
animals,  all  of  the  dopamine  neurons  that  express  the  dopamine 
transporter  will  lack  Tfam,  and  this  results  in  mitochondrial  failure  and 
energy production failure in these particular neurons. 
  Now, to develop these animals, we utilized a double transgenic approach, 
which I’ll talk about in a moment, but essentially it involves crossing two 
transgenic  strains.  This  phenotype  of  the  mouse  is  Parkinsonian‐like  in 
that  the  animals  develop  Parkinson’s  like  behavioral  symptoms  and 
neurochemical  changes  that  are  indicative  of  Parkinson’s  disease  in 
humans  over  a  very  long  time  span.  So,  this  is  an  example  in  which  a 
transgenic  model  is  utilized  to  model  a  human  disease  despite  the  fact 
the  it  targets  a  gene  that  is  not  thought  to  be  involved  in  Parkinson’s 
Slide 10 
  Now,  the  approach  that’s  used  to  develop  these  animals  is  to  cross  two 
strains of mice. The first is a strain of mouse in which the gene of interest, 
in this case Tfam, is flanked by similarly oriented loxP sites. We then take 
a  mouse  who  exhibits  Cre  recombinase  expression  under  the  control  of 
the  dopamine  transporter  and  this  results  in  the  excision  of  the  Tfam 
gene in these animals ‐‐ in the animal crosses. 
Slide 11 
  This is derived from a relatively complex breeding scheme that is shown 
in  this  slide.  So,  for  example  to  derive  the  DAT‐cre  animals,  we  crossed 
animals  that  are  heterozygous  for  the  DAT‐cre  mutation  with  animals 
that  are  homozygous  for  the  Tfam  deletion,  and  we  get  a  strain  of 
animals  that  are  heterozygous  for  both  mutations.  We  then  crossed 
those  animals  with  animals  that  are  a  wild  type  with  regard  to  DAT‐cre 
expression  and  this  results  in  a  variety  of  different  animals.  And  the 

animal  of  choice  in  this  case  is  the  animal  that  is  heterozygous  for  DAT‐
cre  expression  and  homozygous  for  Tfam  deletion.  And  we  call  this 
animal  the  MitoPark  mouse  and  this  is  the  animal  that  exhibits 
Parkinsonian‐like phenotype. 
  One of the problems with this approach is choosing appropriate controls 
for the animals that we utilized in our research. So, the MitoPark control 
mice ‐‐ I mean the MitoPark transgenic mice have to be compared to the 
appropriate control genotypes. 
Slide 12 
  So,  the  advantage  of  this  particular  approach  is  that  you  see  relatively 
normal  development  of  a  human  neurodegenerative  disease  through 
these  double  crosses.  This  does  not  require  the  use  of  neurotoxins  as  is 
seen  in  other  models  of  Parkinson’s  disease.  And  this  has  a  number  of 
advantages, not the least of which is that you can study animals in which 
neurotoxins are not a potential confound. The slower time course of the 
modeled disease in these transgenic animals also permits the evaluation 
of  potentially  beneficial  therapeutic  interventions,  which  is  not  possible 
with more acute models of Parkinson’s disease. 
Slide 13 
  Now,  some  of  the  disadvantages  of  this  approach  are  obvious.  This  is  a 
relatively  complex  breeding  scheme,  which  is  more  costly  in  terms  of 
time and money. And also careful selection of the controlled genotype is 
required in order to compare these animals with the animals of interest, 
in  this  case  the  MitoPark  mice.  Again,  mouse  models  are  not  as  widely 
used as rat and there’s an entire database of Parkinson’s disease research 
that  has  utilized  rat  models.  And  the  use  of  transgenic  mouse  models 
while  providing  information  about  Parkinson’s  disease,  may  not  be  as 
useful  because  they  can’t  be  compared  directly  to  rat  models  that  have 
been used in the past. 
  Now,  the  final  drawback  to  this  approach  is  that  the  time  course  of  the 
disease that’s modeled here is dependent to some degree on the lifespan 
of  the  animal.  So,  rodents  in  general  have  very  short  lifespans  of  two 
years  or  less  and  this,  of  course,  is  not  modeled  ‐‐  does  not  model 
accurately  the  time  course  Parkinson’s  disease  or  other 
neurodegenerative disease in the human. And so, I would suggest that to 
model  chronic  neurodegenerative  disease,  we  might  be  able  to  benefit 
from utilizing transgenic model organisms that have longer lifespans than 
Slide 14 
  I  would  like  to  thank  my  institute,  the  National  Institutes  of  Health  and 
the National Institute on Drug Abuse for permitting me to conduct these 

studies and to speak with you today. And I’d also like to thank Dr. Barry 
Hoffer, Doctors Bruce Hope, Eisuke Koya, and Cristina Bäckman at NIDA, 
as well as Dr. Susan Masino at Trinity College who provided me with the 
adenosine  A
  receptor  knockouts.  And  colleagues  at  the  Karolinska 
Institute  in  Stockholm,  Sweden  who  provided  us  with  the  MitoPark 
animals. And last but not least, I’d like to thank Kriss Knestaut who is our 
wonderful  transgenic  breeding  coordinator  at  the  NIDA  Intramural 
Research Program. 
Slide 15 
Sean Sanders:  Okay. Thank you so much Dr. Lupica. 
  Just  a  note  again  to  our  online  audience  that  we  are  experiencing  some 
technical  issues.  Our  apologies  that  we  don’t  have  video  right  now  and 
that  the  audio  quality  is  limited.  But  I  do  hope  this  won’t  spoil  your 
enjoyment of the webinar and of our speakers’ presentations. 
Slide 16 
  Talking of which, we will now move on to our second speaker and that is 
Dr. Rosalba Sacca. Dr. Sacca received her Ph.D. in Biology from the Albert 
Einstein  College  of  Medicine  in  New  York  and  did  postdoctoral 
fellowships  at  the  Massachusetts  Institute  of  Technology  in  Cambridge 
and  the  Memorial  Sloan‐Kettering  Cancer  Center  in  New  York.  Prior  to 
joining  Pfizer  in  1998,  Dr.  Sacca  was  at  Yale  University  where  she 
researched the role of cytokines in autoimmune disease. Dr. Sacca is now 
the  Director  of  the  Genetically  Modified  Models  Center  of  Emphasis  in 
Worldwide  Research  &  Development  at  Pfizer.  The  center  is  responsible 
for  the  generation  of  in  vivo  and  in  vitro  tools  for  target  validation  and 
disease model development. 
  Welcome, Dr. Sacca. 
Dr. Rosalba Sacca:  Thank you, Sean. Happy to be here. 
Slide 17 
  So, what I’ll do is I’ll step a little bit back and talk about some of the work 
that  my  group  is  doing  at  Pfizer,  the  Genetically  Modified  Models 
Research  Center  of  Emphasis.  And  this  is  a  unique  group  within  Pfizer 
which  focuses  on  the  development  of  genetically  modified  models.  So, 
not just in vivo models  such as the transgenics or knockouts that you’ve 
heard  Carl  talk  about,  but  also  in  vitro  models  where  we  use  the 
differentiation  of  adult  stem  cells  to  provide  in  vitro  assays  for  target 
discovery, assay development, and compound screening. 
  So, what I’d like to do today is give you a broad overview of the way that 
we use these genetically modified models to help us validate new targets 
as  well  as  understand  the  pharmacology  of  the  targets  of  interest.  And 

then switch over a little bit and talk about the next generation of models, 
the types of models that we see can be of use in the future. And that’s a 
little  bit  about  our  imaging  models,  our  recorder  models.  I’ll  show  some 
examples  of  that  as  well  as  our  humanized  models.  And  then  perhaps 
some work that we can do with other species as well. 
Slide 18 
  So, in this first slide, I simply wanted to outline some of the reasons that 
mouse  models  are  a  critical  tool  in  drug  discovery.  First  of  all,  they  are 
very useful, as you’ve seen a great example of what Carl has just spoken 
about,  to  validate  the  mechanisms, the  biology  behind  a  particular  gene 
of  interest  ‐‐  especially  when  we  have  very  little  information  about  that 
gene.  We  can  also  use  mouse  models  to  give  them  our  test  compounds 
or new drugs of interest, and understand whether those compounds are 
selective. And they can serve also as a screening tool to help us find the 
best compound. 
  Because we can use inbred strains of mice, we can cut down on a lot  of 
variability that we can use that to our advantage. Although, occasionally 
as  you  heard,  that  can  be  confusing  when  you  have  different  responses 
and different strains. For certain assays, it’s nice to have a very controlled 
environment,  which  is  an  inbred  organism.  Because  we  can  use  large 
numbers  of these  animals,  we can  do  statistically  powered experiments. 
We  can  do  large  studies  without  some  of  the  ethical  concern  that  you 
may  have  with  larger  animals,  and  of  course  at  a  reduced  expense.  And 
finally,  really  the  major  advantage  over  the  last  15  years  or  more  is  our 
ability  to  genetically  manipulate  these  animals.  So,  we  can  make  those 
specific  knockouts  of  genes,  we  can  introduce  human  genes  into  a 
mouse, we can over express genes in that mouse. 
  However,  there  are  a  number  of  limitations  associated  with  the  use  of 
these  genetically  modified  models  and  so  we  keep  those  in  mind  as  we 
think about the next generation of models. For example, it takes almost a 
year  to  generate  a  knockout  model.  It  can  be  expensive  and  the  results 
that you see in our own model may not always translate to what you will 
see  in  the  patient.  In  addition,  once  you  generate  that  model  there’s 
quite  a  lot  of  investment  in  phenotyping  that  animal  and  really 
understand what knocking out that specific genes will do. 
Slide 19 
  So,  taking  into  consideration  all  the  advantages  and  some  of  the 
limitations, I wanted to highlight one way that we’ve tried to extract the 
most  value  out  of  our  models,  and  that  is  by  doing  comprehensive 
phenotyping. So what this involves is really putting ‐‐ when you knock out 
a  gene  in  an  animal,  we  put  that  animal  through  a  thorough  physical 

trying  to  understand  all  the  parameters;  metabolic  parameters, 
behavioral  parameters,  that  maybe  affected  by  our  ability  to  knock  out 
that gene. 
  So  why  would  we  do  that?  Well,  we  found  that  about  50%  of  all  the 
knockouts  that  we’ve  made  have  yielded  a  very  unexpected  phenotype. 
So, although, we had good intentions and good understanding about that 
target,  it  turned  out  that  in  vivo  when  you  deleted  it,  it  didn’t  actually 
behave  the  way  we  thought.  So,  the  idea  of  systematically  identifying 
new phenotypes and potentially any adverse effects associated with our 
genetic  manipulation  was  very  appealing.  So,  we  developed  a  platform 
where we would have 50 knockout animals and 50 wild type animals and 
evaluate it through whole array of assays. And this was done sequentially 
so that over a short ‐‐ relatively short period of time of 17 weeks, we’re 
able to have a comprehensive understanding of that model. And then all 
of that data was deposited in a database which was available to all of our 
Slide 20 
  So,  in  addition,  in  trying  to  exact  the  most  value  out  of  our  transgenic 
animals,  we  have  moved  over  to  more  and  more  using  bioluminescence 
imaging. So creating recorder animals where either we use luciferase, as 
you  heard  from  Carl,  or  fluorescent  proteins  to  use  them  as  platform 
models so that we can ask multiple questions of that one model that we 
Slide 21 
  So,  an  example  is  shown  on  this  slide  where  we  have  generated  an 
animal,  a  transgenic  animal,  where  we  can  evaluate  any  cyclic‐AMP 
response  element  gene  expression,  which  results  from  CREB‐mediated 
signaling.  So,  what  this  means  is  that  changes  in  cyclic‐AMP  within  the 
animal will be seen as a change in luciferase expression. 
  So, if you look on the right‐hand side of the slide. At the bottom what you 
will see is that in a case where we are treating the animal with a specific 
inhibitor  of  a  phosphodiesterase,  which  will  result  in  increased  level  of 
cyclic‐AMP, that animal, which is the lower three panels, just shows three 
examples  that  you  see  an  increase  in  luciferase.  And  we  know  that  this 
specific inhibitor acts in the brain and we see that luciferase expression in 
the brain. 
  And  then  we  can  use  the  same  exact  animal  after  a  few  days  in  a 
different ‐‐ to ask a different question. So that’s what’s shown on the left 
panel  where  we  actually  ‐‐  if  we  fast  the  animals  and  then  give  them 
glucagon,  we  know  that  this  results  in  an  increase  in  cyclic‐AMP  in  the 
liver.  And  sure  enough  when  we  look  at  these  animals  in  our  imaging 
system,  we  see  on  the  right  side  of  that  figure  that  in  response  to 
treatment,  there  is  an  increase  in  luciferase  expression  in  the  liver  of 
those  animals.  So,  our  ability  to  use  the  same  animals  over  to  ask 
questions  in  neuroscience  as  well  as  questions  about  their  metabolism, 
again  gives  us  a  way  of  extracting  more  value  out  of  these  animals  that 
we’ve generated. 
Slide 22 
  So,  I  want  to  transition  a  little  bit  now  and  talk  about  humanized  mice. 
And  this  speaks  back  to  the  translation;  our  ability  to  try  to  get 
information from a mouse, which will help us translate what we learn in 
that mouse to the human system. 
  So, we have done this in three different ways. You can humanize a mouse 
at  the  genomic  level  or  what  we  call  a  knock‐in.  We  can  do  it  by 
transferring cells into a mouse, such as human peripheral blood cells, and 
this would be done using an immunocompromised mouse. Or we can do 
it by actually making chimeric mice where we put stem cells into the liver 
for example and humanize that particular organ; a human liver. So, in the 
next couple of slides I’ll give you examples of all of these. 
Slide 23 
  So, in this particular case, our interest was the thrombopoietin receptor, 
which  is  a  primary  factor  in  the  growth  and  differentiation  of  mature 
platelets.  The  challenge  that  we  faced  here  is  that  our  lead  drug 
compound  was  species  specific.  So,  it  did  not  recognize  the  mouse 
receptor.  So,  there  were  no  available  models  to  test  some  of  our 
compounds  to  better  understand  their  metabolic  pharmacology.  So,  we 
needed  to  generate  a  humanized  model.  So,  just  a  schematic  on  the 
bottom shows that we were able to replace part of the humanized gene ‐
‐  I  mean  the  mouse  gene,  especially  the  transmembrane  region  of  the 
receptor in an area near it, with a human sequence and thereby generate 
a humanized mouse.  
Slide 24 
  And  this  shows  the  results  of  an  experiment  where  we  took  our 
compound, which we knew was human‐specific, and showed that in wild 
type ‐‐ and the read out from this experiment was looking at an increase 
in the number of platelets. So, you can see on the left in the wild type the 
compound  had  no  effects  in  three  different  animals  at  three  different 
times.  Whereas  in  the  humanized  where  we  knocked‐in  the  human 
region, we saw that there was an increase in platelet number in response 
to this concentration of compound.  
Slide 25 
  In  addition  to  just  being  able  to  show  that  the  compound  is  binding  to 
that  receptor,  and  thereby  telling  us  that  there  is  a  specific  effect  going 
on,  we  also  used  this  animal  to  establish  how  much  exposure  to  the 
compound  you  needed  to  have  a  therapeutic  effect.  So,  the  top  shows 
that a different concentration of the compound, you have an increase in 
the  platelet  number.  And  the  bottom  shows  that  the  therapeutic  effect 
that  we  see,  which  is  an  increase  in  platelet  number,  is  related  to  the 
amount  of  compound  that’s  present  in  the  system.  So  in  addition  to 
doing this, we can use this data to better understand what kind of doses 
we may need in humans and as well these models can also be used later 
on  to  understand  if  there  are  any  toxicity  effects  as  well.  So,  as  I 
mentioned,  so  that’s  an  example  of  how  you  can  humanize  a  mouse  at 
the gene level.  
Slide 26 
  In  terms  of  transplantation  models,  we’re  pursuing  different  types  such 
as, as I mentioned, transferring either human adult peripheral blood into 
an  immunocompromised  model,  and  thereby  developing  certain  models 
such as graph versus host disease models to understand how some of our 
monoclonal  antibodies  may  work.  Human  cord  blood  transplantation 
model  is  where  this  is  more  of  a  long‐term  model  where  we  humanize 
the immune system. Except again none of these are perfect and there are 
challenges  associated  with  it.  In  this  particular  one,  we  know  that  the 
lymphoid system is very immature. 
  And  then  we’ve  done  some  collaborative  work  to  also  try  to  humanize 
the  liver.  And  this  is  particularly  important  because  of  some  of  the  side 
effects that have been seen with some drugs in terms of hepatotoxicity. 
So,  the  ability  to  have  in  one  model  both  human  cells  and  mouse  cells 
and  be  able  to  see  how  each  of  those  responds  to  a  particular  drug  will 
be  very  powerful.  So,  we’re  very  excited  about  some  of  the  early  work 
that we’ve done in collaboration with Yecuris. 
Slide 27 
  And  finally,  another  example  of  sort  of  the  next  wave  of  genetically 
modified  models  is  one  that’s  been  developed  in  collaboration  with 
Viacyte.  And  this  is  their  data  showing  that  you  can  engraft  pancreatic 
endoderm  into  a  mouse,  and  these  cells  will  differentiate  and  actually 
look  like  bona  fide  human  islets.  And  they’ve  been  shown  to  be  able  to 
produce  glucagon,  somatostatin,  and  insulin.  So,  again,  thinking  about 
the next generation of models, which will help us better understand the 
effects of our drugs in humans. 
Slide 28 
  And  what’s  next?  So,  I’m  sure  many  of  you  have  heard  about  zebrafish 
and  many  of  the  advantages  associated  with  zebrafish.  They’re  small, 
they  reproduce  quickly,  they’re  low  maintenance,  and  again  we  can 
manipulate their genome. Of course, there are limitations with zebrafish 
as well such as translation and bioavailability. If you throw a compound in 
their  water,  how  much  do  they  take  up  and  the  kinetics  of  that  is 
challenging.  But,  again,  some  examples  that  have  been  in  the  literature 
such as the one highlighted on the right of this slide, where they used the 
atrogin‐1  promoter  linked  to  luciferase  as  a  reporter  to  look  for  drug‐
induced  myopathy,  are  very  interesting.  And  this  type  of  model  could 
help us fill the gap between in vitro assays and in vivo models, and would 
have a great impact in terms of the lower cost and high throughput with 
which we could screen our drugs. 
Slide 29 
  And  finally,  I’d  like  to  finish  with  talking  a  little  bit  about  the  rat.  I  think 
Carl mentioned how for many years, the rat has been a preferred model 
in  research  and  development.  And  until  recently,  we  really  haven’t  had 
the ability to manipulate the rat genome due to the lack of the availability 
of embryonic stem cells that were germline competent. But new progress 
to  date  such  as  the  Zinc  Finger  Nuclease  technology  and  a  recent 
publication showing germline‐competent rat cells makes use very excited 
about  this  opportunity.  So,  we’re  currently  in  a  collaboration  with  the 
SAGE Labs in the production of a knockout rat and we’re very excited to 
see what the results of that will be. 
Slide 30 
  And  finally,  I  just  want  to  acknowledge  all  the  people  in  my  group  who 
have done the work that I’ve discussed. As well as our partners in safety, 
in comparative medicine and the various therapeutic areas who we work 
closely with. Thank you. 
Sean Sanders:  Okay. Thank you so much, Dr. Sacca. 
Slide 31 
Slide 32 
  Our  final  speaker  today  is  Dr.  Kerry  Ressler.  Dr.  Ressler  received  his 
Bachelor’s of Science degree in molecular biology from MIT and his M.D.‐
Ph.D. from Harvard Medical School. Dr. Ressler is now an investigator of 
the  Howard  Hughes  Medical  Institute  and  an  Associate  Professor  of 
Psychiatry  and  Behavioral  Sciences  at  Emory  University  School  of 
Medicine  and  the  Center  for  Behavioral  Neuroscience.  His  current  work 
focuses  on  translational  research  bridging  molecular  neurobiology  with 
human  genetic  research  on  fear  and  anxiety  disorders.  His  clinical 
research  focuses  on  the  genetics  and  endophenotypes  that  underlie 
posttraumatic  stress  disorder  with  the  goal  of  understanding  the 
molecular  mechanisms  of  genetic  loci  that  contribute  to  fear‐related 
disorders. Dr. Ressler? 
Slide 33 
Dr. Kerry Ressler:  Thanks  very  much  Sean  for  the  opportunity.  So,  I’m  going  to  follow  up 
with a few of the examples following on what Carl and what Rosalba have 
already told you about, about some of those tools. But really focusing on 
animal  models  specifically  targeted  towards  understanding  neurological 
and psychiatric illnesses requiring very specific regulation of genes within 
certain parts of the brain. And so these are taking advantage of some of 
these tools to look at gene specific, cell type specific, region specific, and 
time specific regulation of genes. 
  So,  the  first  point  I’ll  be  making  is  the  importance  of  inducible  knockout 
systems  in  studying  behavior  and  studying  emotional  learning  and 
memory,  which  is  our  primary  focus  of  our  lab.  Several  examples  being 
able to knockout a specific gene, in one case Brain Derived Neurotrophic 
Factor  (BDNF),  in  cortical  amygdala  and  hippocampal  regions  leading  to 
different  phenotypes.  Several  other  examples  of  region  specific 
knockouts  followed  by  examples  of  replacement  of  region  knockouts. 
And  then  finally  several  other  new  transgenic  models,  specifically 
nonhuman  primate  and  a  prairie  vole  model,  which  allows  to  use  very 
specific species that are unique for specific questions related to behavior. 
Slide 34 
  Related  to  studying,  learning,  memory,  and  emotion,  it’s  very  important 
to  recognize  that  learning  and  memory  processes  utilize  highly  dynamic 
and  specific  brain  circuits.  And  until  we  can  regulate  gene  expression, 
very  specifically  within  these  brain  circuits  in  a  time‐dependent  way,  we 
can’t use genetics to its full ability.  
  The  primary  goals  to  understand  the  molecular,  cellular,  and  circuit 
mechanisms  underlying  emotional  memory  as  well  as  declarative 
memory, for example in degenerative disorders and dementia.  
  Transgenic  and  standard  knockouts  are  often  inadequate  because  we 
ideally again need spatially and regionally specific knockouts or we need 
to  be  able  to  replace  those  genes.  And  the  ideal  models  rely  on  a  high 
degree  of  inducibility  both  in  specific  regions  and  specific  times  relative 
to a learning event. 
Slide 35 
  So,  in  the  next  few  slides,  I’m  going  to  talk  about  a  series  of  studies  in 
which  we  knock  out  the  Brain  Derived  Neurotrophic  Factor  (BDNF)  gene 
which  has  been  highly  involved  in  neuroplasticity  across  a  number  of 
  With  regard  to  learning  and  memory  of  emotion,  this  is  a  complex 
behavior,  which  is  relatively  well  understood.  And  at  the  center  of  it  is 
the regulation of fear responses by the amygdala and that’s regulated by 
different  pre‐frontal  cortical  regions;  the  infralimbic  as  well  as  the 
prelimbic  prefrontal  cortical  regions  which  have  well  understood 
homologues  in  humans  as  well  as  the  role  of  the  hippocampus.  And  so 
we’ve  done  a  number  of  studies  in  which  we  can  knock  out  BDNF  in 
specific  parts  of  the  brain  and  look  at  the  effects  on  learning  and 
Slide 36 
  And  Carl  nicely  showed  how  Cre  recombinase  works  by  recognizing  the 
loxP sites. In this case, we’re using a mouse originally identified and made 
in  Rudy  Jaenisch’s  Lab  at  MIT  in  which  we  can  do  site  specific  inducible 
knockouts of the BDNF gene.  
Slide 37 
  This particular paper shows two different tools used to knock out BDNF in 
one specific sub region of the prefrontal cortex. So, on the left slide, we 
see a series of brain sections in which the blue reporter is the LacZ Rosa 
reporter  mouse  in  which  we  can  see  Cre  gene  expression  only  in  the 
cortex.  And  what  we  notice  on  the  bottom  left  is  that  Cre  expression  is 
shown in panel B. D shows normal BDNF expression, and C shows cortical 
specific knockout in the same places that Cre is normal shown. 
  Another  approach  uses  a  genetically  modified  Lentivirus  to  express  Cre 
only in brain regions in which we infect with the Lentivirus. And so again, 
we see at the top there blue cells that have been infected with the LV‐Cre 
leading  to  reporter  expression.  Panel  C,  D,  and  E  show  ‐‐  panel  C  shows 
specifically where the Lentivirus is expressed in that small prelimbic area. 
Panel D shows where BDNF is now missing where that’s expressed and E 
shows the overlay. 
  The  take‐home  points  of  this  sort  of  approaches  are  they  allow  us  to 
knock  out  gene  in  an  adult  animal  at  a  specific  time  point  relative  to 
when learning occurs. And as we see in the bottom right panel; although, 
the  take‐home  results  of  this  study  was  that  all  animals  learned  to  be 
afraid equivalently in A, panel B and C show that when they express fear, 
those  in  which  we’ve  knocked  out  BDNF,  specifically  in  this  cortical 
region, they do not express fear at all. And so that is one sort of approach 
that  allows  us  to  show  the  role  of  prefrontal  cortex  in  emotion 
Slide 38 
  Another  example  of  this  is  hippocampus‐specific  knockouts  and  again 
panels  on  the  left  show  BDNF  expression,  Cre  recombinase  expression, 
and the overlay in which we’ve again used the Lentivirus to over express 
Cre and thus knock out BNDF, specifically in the dorsal hippocampus. And 
what  we  find  there  is  a  number  of  hippocampally‐dependent  behaviors 
that are disrupted. For example, in panel A we see water maze, which is a 
method of spatial learning. Those who have Cre knockouts of BDNF in the 
hippocampus have a slower time point of learning where the platform is ‐
‐  so  spatial  learning.  And  the  novel  result  in  this  particularly  study  is  on 
the  bottom  showing  again  extinction  or  inhibition  of  fear  memories 
requires BDNF in the hippocampus.  
Slide 39 
  Another  area  is  specifically  the  amygdala  within  fear  related  and 
emotionally  related  memories.  One  of  the  downstream  effector  genes 
following  BDNF  activation,  is  β‐catenin,  which  is  involved  with  the  WNT 
system is involved in a whole host of cellular plasticity events. And in this 
particular  study,  we  were  able  to  show  that  knocking  out  the  amygdala, 
the  β‐catenin  only  within  the  amygdala,  led  to  specific  learning  and 
memory  deficits.  So  in  the  bottom  left  panel  on  the  right  side  of  that 
animal, the animal had received a Cre injection and on the left side, they 
had not or received a control injection. The bottom panel C shows again 
the Cre expression, the β‐catenin expression and the overlay in which we 
could  do  a  specific  amygdala  knockout  of  this  β‐catenin  gene.  And  then 
on  the  right  side,  we  found  that  those  animals  in  which  we  had  deleted 
BDNF ‐‐I mean sorry ‐‐ deleted β‐catenin in this particular example in the 
amygdala had a deficit in memory recall.  
Slide 40 
  New  approaches  are  taking  advantage  of  cell  type  specific  promoters. 
Carl mentioned the dopamine transporter. In this particular case, we are 
using a CRF or corticotropin‐releasing factor promoter to allow us to drive 
Cre expression only in CRF neurons. And you see in the blue in panels E, 
F, and G that we see Cre expression, specifically in the central amygdala, 
the bed nucleus of the stria terminalis, and the paraventricular nucleus of 
the  hypothalamus;  all  three  regions  that  are  highly  involved  in  stress 
responsivity  and  in  stress  and  fear  regulation.  And  so  this  animal  is  now 
being  crossed  with  a  number  of  deleter  strains  and  reporter  strains  to 
understand  the  role  of  these  specific  neuronal  populations  in  fear  and 
Slide 41 
  Another  example  is  looking  at  the  role  of  specific  sensory  systems.  The 
olfactory  system  is  particularly  amenable  to  genetic  approaches  in  that 
there are over a thousand different specific genes that all express specific 
odorant  receptors,  and  each  set  of  neurons  expressing  a  particular 
receptor projects to a specific glomerulus in the olfactory bulb.  
  Peter Mombaerts, a number of years ago, showed that knock‐in animals 
in which they express the reporter lacZ allowed when we specifically look 
at  the  molecular/cellular  pattern  of  expression  of  a  single  odorant 
  We recently showed that fear learning and stress in an adult animal that 
is paired with specific odorants leads to alterations in the sensory system. 
And so on the bottom left, one sees that animals that have been trained 
to  pair  a  specific  odor  with  a  fear  cue,  have  increased  innervation  and 
larger  representations  of  that  odor  in  those  specific  genes  representing 
that odorant receptor than do animals that were not trained.  
Slide 42 
  Rosalba  referred  to  humanized  mice.  One  specific  very  exciting  example 
in  the  psychiatry  and  CNS  field  came  from  this  paper  in  Science.  Francis 
Lee’s group  a number of years ago  showed that the Val mutation of the 
BDNF gene in humans led to a less efficient BDNF protein. And that there 
have  been  a  number  of  depressive  disorders  and  other  psychiatrically 
relevant disorders associated so far, which has altered BDNF expression. 
They  went  on  to  show  that  they  can  make  a  mouse  in  which  they  took 
the human BDNF, replaced it with both a wild  type Met allele as well as 
the  Val  allele.  And  this  particular  recent  Science  paper  showed  that 
humans with the Val allele ‐‐ sorry ‐‐ it’s actually the Met allele that has a 
deficit.  The  humans  with  the  Met  allele  have  a  decrease  in  extinction  of 
fear.  So,  on  panel  B,  it  shows  that  before  extinction  and  after  extinction 
the  Met  carriers  remained  more  afraid  as  opposed  Val/Val  carriers  in 
which they had a decrease in fear.  
  Similarly,  the  humanized  mouse,  those  that  were  the  Met  carriers, 
remained more afraid whereas the Val carriers had a significant decrease 
in their fear. So, this is an exciting model of using a humanized specifically 
for behavioral question.  
Slide 43 
  Another  set  of  studies  from  Rene  Hen  and  Jay  Gingrich’s  group  at 
Columbia  showed  that  a  specific  serotonin  receptor  was  required  for 
anxiety  phenotypes.  They  knocked  out  that  receptor  first  showing  that 
they had a significant alteration in anxiety, and then they replaced it with 
a  specific  promoter  that  allowed  only  cortical  specific  replacement.  And 
they  showed  both  a  normalization  of  the  anxiety  behavior  and  a 
normalization of the serotonin physiological response in the bottom left.  
Slide 44 
  This  is  a  recent  study  in  Nature  from  Anthony  Chan’s  group  at  Emory  in 
which  they  have  shown  that  they  can  make  transgenic  Macaque 
nonhuman primates or Macaque monkeys. And the nonhuman primate is 
particularly useful for studying unique human disorders and Huntington’s 
disease is one of those ‐‐ they’re now looking at Alzheimer’s disease and 
Parkinson’s as well. In this particular case, one can see that the Macaques 
were  made  to  express  GFP  as  well  as  overexpress  Huntington’s  protein. 
And  when  they  overexpress  Huntington  protein,  they  both  saw 
alterations  in  the  brain  consistent  with  pathology  as  well  as  the 
movement disorder phenotype of Huntington’s disease.  
Slide 45 
  This  study  ‐‐  another  animal  model,  again  a  rodent  in  this  case,  but  it’s 
the prairie vole. Larry Young at Emory has done a number of studies over 
the  years  showing  the  prairie  vole  is  a  particular  useful  animal  for 
studying  pair  bonding  and  appetitive  behaviors  of  social  behavior.  And 
they’re now able to start looking at the genetic underpinnings of that by 
using Lentiviruses to make transgenic prairie voles.  
Slide 46 
  So,  in  summary,  I  think  there  are  a  number  of  very  exciting  tools  being 
able  to  do  inducibility,  but  they  are  number  of  limitations.  That  the 
current  tools  are  limited  in  terms  of  looking  at  complex  disease  and 
behavior.  It’s  important  to  have  inducibility.  It’s  important  to  be  able  to 
look across  species that potentially provide more specific, useful models 
for a disease.  
Slide 47 
  So, thank you very much.  
Sean Sanders:  Great. Thank you so much Dr. Ressler. And thank you to all of you for the 
excellent  and  fascinating  presentations.  We’re  now  going  to  get  on  to 
some of the questions that have been submitted by our viewers. 
Slide 48 
  A  quick  reminder  to  those  of  you  watching  us  live  that  you  can  submit 
your  questions  by  just  typing  them  into  the  ask‐a‐question  box  and 
clicking the submit button.  
  So, our first question, which I’m going to put to all of you, is do you think 
anything  can  be  learned  through  the  comparison  of  rat  and  mouse 
models in which the same gene is knocked out or knocked in? So, maybe 
Dr. Lupica, we’ll start with you.  
Dr. Carl Lupica:  Well,  yeah,  that’s  a  very  interesting  question.  I  think  you  can  gain 
valuable information by comparing the same knockout across species. For 
one, you can determine the interaction of that particular gene or protein 
with  the  particular  species.  So,  one  of  the  examples  I  used  earlier  was 
that  the  knock  out  of  a  single  receptor  in  two  different  strains  of  mice 
resulted in a very different behavioral phenotype. Well, that could also be 
done  across  species;  between  rat  and  mouse.  You  might  find  an 
interesting  result  and  that  might  lead  you  to  information  that  could  be 
very  valuable  regarding  the  role  of  that  gene  in  that  particular  species’ 
Sean Sanders:  Okay. Dr. Sacca?  
Dr. Rosalba Sacca:  Yes, I completely agree and I would add to what Carl said. In terms of our 
drug discovery programs, when we used rodent models to also check for 
toxicity of a compound, we have seen on occasion that in a rat, you may 
have a toxic response to a compound, but the same response would not 
be observed in a mouse. So, I think, there’s always value in not relying on 
just one model.  
Dr. Kerry Ressler:  I  think  another  point  is  the  number  of  decades  for  which  in  recent 
behavior  and  neuroscience  approaches,  the  rat  has  been  the  critical 
model species. And so by being able to use the rat and other species like 
the  vole  that  I  showed,  one  can  take  advantage  of  decades  of  behavior 
work  really  working  out  the  circuitry  and  the  specific  behaviors  of  one 
species over another.  
Sean Sanders:  Fairly  straightforward  question,  “Why  didn’t  we  have  a  knockout  rat 
sooner? What’s changed? What have been the developments recently?” 
Dr. Sacca?  
Dr. Rosalba Sacca:  Well,  it’s  been  the  Holy  Grail  trying  to  get  a  rat  knockout.  And  the  main 
impediment  was  the  ability  to  derive  from  rats  embryonic  stem  cells, 
which  could  be  cultured  in  vitro  and  genetically  manipulated.  And  then 
putting those cells back into a blastocyst and having those cells maintain 
the  ability  to  enter  the  germline  and  generate  a  knockout.  So,  that  has 
not been possible.  
  But  as  I  mentioned  in  my  presentation,  there  was  just  a  recent 
publication  showing  that  by  finding  the  right  kind  of  factors  and,  you 
know,  changing  the  culture  media,  they  were  actually  able  to  generate 
embryonic  stem  cells,  which  are  germline  competent.  So,  we’re  very 
excited about those results; although, the efficiency is still low, but again, 
those are things that will give us hope of getting to an easy way to getting 
rat knockouts. And also this new Zinc Finger Nuclease technology where 
you  can  knock  out  any  genes  in  the  rat  again,  you  know,  shows  a  lot  of 
promise in getting us there.  
Dr. Kerry Ressler:  I  want  to  ‐‐  I  wasn’t  aware  until  recently  with  the  Zinc  Finger  approach 
that it doesn’t ‐‐ you skip the embryonic stem cell stage, is that ‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  That’s right. 
Dr. Kerry Ressler:  ‐‐ could you say a little bit more about that? 
Dr. Rosalba Sacca:  Yeah.  So,  the  way  it  works  is  that  ‐‐  and  I  don’t  know  if  it’s  feasible  to 
bring up that slide or not, but that the way it works is that a Zinc Finger 
protein  is  made  of  ‐‐  it  has  a  sequence  recognitions  piece  as  well  as  a 
nuclease piece; so it has two domains. 
Slide 29 
  The  designer  sequence  can  be  made  to  any  gene  and  the  nuclease 
basically  acts  as  a  restriction  enzyme.  So,  because  it  can  only  work  as  a 
dimer, it increases the possibility of it binding to a very specific region so 
you’re not knocking out random genes, but you’re knocking your gene of 
interest.  And  then  this  is  injected  into  a  mouse  embryo  or  a  rat  embryo 
and  basically  it’s  similar  to  making  a  transgenic  animal.  So,  you  identify 
founder lines and then breed them to identify your ‐‐ 
Dr. Kerry Ressler:  And the idea is that it works with cell specificity, you don’t have to do the 
screening of hundreds of clonal lines‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  Right. 
Dr. Kerry Ressler:  ‐‐ you can just directly ‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  Yes. 
Dr. Kerry Ressler:  That’s cool. 
Dr. Rosalba Sacca:  However, you know, science isn’t perfect. 
Dr. Kerry Ressler:  Right. 
Dr. Rosalba Sacca:  So, there’s always the possibility that other things could be affected. So, 
you  always  have  to  do  a  little  bit  of  due  diligence  in  looking  at  other 
genes  that  have  sequences  similar  to  yours,  and  making  sure  that  those 
have not been impacted. 
Sean Sanders:  And  that  can  be  used  for  literally  any  ‐‐  any  animal  because  you  don’t 
have to worry about culturing ES cells? 
Dr. Rosalba Sacca:  In principle, in vivo as  well as in vitro. So, you  can take, in principle, any 
cell line and knock out any gene in vitro as well as in vivo. 
Slide 48 
Sean Sanders:  What ‐‐ how do you pick the best model to work with in your work? And 
I’m talking about whether you’re going to choose a rat, a mouse, a rabbit, 
a zebrafish. What are some of the considerations that you would use? Dr. 
Dr. Kerry Ressler:  Well, I can ‐‐ I think the vole is a particularly interesting example. This is 
by  Larry  Young’s  group.  It  had  initially  been  started  by  Tom  Insel.  And 
what  they  found  a  number  of  years  ago  for  example  was  that  two 
different species of vole that are highly similar; the prairie and the meta 
vole,  they  seem  very  similar  genetically,  very  similarly  behaviorally 
otherwise. But once specific species of vole was monogamous and mated 
for  life  and  the  males  had  a  very  strong  impact  in  parental  behavior 
whereas  the  other  species  was  polygamous  and  the  males  weren’t 
involved at all. And they went on to show after a number of years of work 
that  that’s  due  to  the  oxytocin  and  vasopressin  receptor  genes, 
specifically  in  the  appetitive  behavior  regions.  So,  that’s  one  particular 
model  in  which  the  whole  animal  model  built  up  around  trying  to 
understand  one  specific  species.  But  in  the  behavioral  neurosciences 
there  are  many  indications  of  similar  types  of  stories.  So  for  us,  it’s  the 
animal  which  displays  the  behavior  innately  that  seems  to  be  the  most 
close to the one we’re interested in studying. 
Sean Sanders:  Dr. Lupica? 
Dr. Carl Lupica:  Well,  my  research  and  I  think  the  research  of  many  neuroscientists  has 
been driven by necessity to utilizing mouse transgenic animals. And that’s 
because  the  mouse  has  been  the  primary  workhorse  for  transgenic  and 
genetically  engineered  strategies.  Unfortunately,  the  mouse  may  not  be 
the  best  model  because  there  are  decades  of  research  in  the  central 
nervous system that were accomplished using other animal models such 
as  the  rat  and  other  animals  as  well,  but  primarily  in  the  rat.  So,  the 
development of many of these transgenic models or additional transgenic 
models  in  rats  would  allow,  I  think,  a  more  direct  comparison  between 
the  information  gained  from  the  modern  transgenic  animals  to  the 
information  that  was  gained  with  rats  in  the  decades  before  the 
transgenic mouse came along. 
Sean Sanders:  Great. A more specific question, maybe Dr. Sacca you can answer this or 
Dr. Lupica. Has the Cre‐Lox system been demonstrated to work efficiently 
in  non‐mouse  mammals?  And  what  about  Cre  deleter  animals  in  non‐
mouse mammals? 
Dr. Rosalba Sacca:  So,  my  experience  has  mainly  been  with  mouse  models.  And  we  know 
that,  you  know,  there  are  issues  with  efficiencies  in  mice  in  terms  with 
the  Cre‐Lox  system.  But  you  know,  they  have  gotten  better  over  the 
years. In terms of non‐mouse models, I guess I can’t comment on that. I 
don’t know if any of the ‐‐ 
Dr. Kerry Ressler:  Yeah. Yeah, think it would depend ‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  ‐‐ other panelists… 
Dr. Kerry Ressler:  I mean you have to be able to do a knock‐in to flank with loxP that’s the 
very gene you’re interested in. 
Dr. Rosalba Sacca:  Right. 
Dr. Kerry Ressler:  So that’s been limited by the ability to do the targeted knock‐ins ‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  Right. 
Dr. Kerry Ressler:  ‐‐ and homologous recombination. 
Dr. Rosalba Sacca:  So, currently the most we know I think is with the mouse models. 
Dr. Kerry Ressler:  I mean I do know people have used viral vectors to use Cre and Lox in rat 
as well as in cell lines. So, if it works as well in a cell line and again in like 
Hex  cells,  which  are  human  cell  lines,  presumably  if  you  can  targettedly 
knock in the loxP, it should work as well in other lines. 
Sean Sanders:  A fairly broad question for you now. Can the panel comment on the state 
of research with tissue specific knockouts? What are the advantages and 
limitations  of  these  models  and  how  might  the  use  of  rats  impact  this 
area? Who would like to start? [Laughs] 
Dr. Kerry Ressler:  Well,  I  think  I  alluded  to  this  issue  earlier  and  in  fact  a  couple  of  us  did 
when  we  referred  to  promoter‐driven  knockouts  and  promoter‐driven 
expression  of  transgenes.  I  think  this  has  been  a  very  fruitful  area  of 
research  because  it  allows,  especially  those  of  us  interested  in  central 
nervous  system  function,  to  target  select  populations  of  neurons  with  a 
particular knockout or knock‐in or overexpression. So, I think, that kind of 
answers the question regarding tissue specificity.  
  In  this  case,  we’re  talking  about  neuronal  specificity  and,  of  course, 
neurons  are  very  heterogeneous,  and  a  number  of  select  promoters  are 
found in specific neuronal classes. So, I think, that’s a very advantageous 
model. And, of course, its applicability to the rat would mean ‐‐ would get 
back  to  the  question  I  answered  earlier  that  is  that  you  can  then 
generalize  that  information,  I  think,  more  readily  to  the  vast  majority  of 
information  that’s  been  gathered  over  the  years  about  the  central 
nervous system in a rat.  
Dr. Rosalba Sacca:  And,  you  know,  I  would  add  to  that  that  it’s  ‐‐  you  know,  one  of  the 
limitations of knocking out a gene globally, which Carl mentioned, is that 
sometimes in the embryo it may cause lethality. So then you’re not able 
to  learn  about  the  function  of  that  gene  in  an  adult  because  you’ve 
knocked it out so early on and the mouse isn’t viable. On the other hand, 
by  using  tissue  specific  ‐‐  you  know,  the  system  that’s  tissue  specific, 
what you can do is have that gene present during development and have 
the  animal  develop  normally,  and  then  knock  it  out  in  the  adult.  And 
thereby  you  can  regulate  when  it’s  on  or  off  and  learn  more  about  its 
actual function in the adult. And then you can use that model to help you 
understand  how  to  regulate  it  better.  So  I  think,  you  know,  it’s  an 
incredibly powerful tool that, you know, we use regularly. 
Sean Sanders:  And  as  a  follow‐up  question  to  that  ‐‐  asking  if  there  are  any  resources 
that  would  allow  researchers  to  find  promoters  that  are  not  only  tissue 
specific, but also tissue exclusive. Something you’ve encountered before. 
Dr. Kerry Ressler:  I mean, I think one thing that certainly deserves mention as we have new 
tools  in  genetics,  the  human  brain  ‐‐  I  mean  the  human  genetic,  you 
know, tools have become so powerful is the Allen Brain Atlas. So, at least 
in  the  neuroscience’s  perspective  the  Allen  Brain  Atlas  has  mapped,  at 
least  in  mice,  starting  to  in  human,  and  looking  in  a  number  of  new 
species, the gene expression of essentially all major genes that are in the 
genome. And so that’s one very quick and publicly available way one can 
look at patterns of any given gene expression. But again, whether you’re 
looking  at  it  for  non‐brain  expression,  I  don’t  know  that  there’s  been  an 
equivalent shared database to look across other tissues. 
Sean Sanders:  What are some of the advantages to using transgenic animals other than 
mice  and  potential  benefits?  We’ve  talked  a  little  bit  about  them  and 
maybe we could expand on what the rat might provide and all the way up 
to primates. 
Dr. Rosalba Sacca:  Yeah.  So,  I  could  start.  I  mean  I  know  in  drug  discovery,  rat  has  always 
been the preferred model for doing pharmacology and metabolic studies. 
And simply because it’s bigger so it’s easier to handle and you can draw 
blood from it, you can obtain ‐‐ you know, they are easy to manipulate. In 
terms of behavior studies, I know that my colleagues in the neuroscience 
group like rats because they tend to learn more quickly, they’re smarter, 
and I think Carl alluded to that as well. So, they have been the preferred 
tool for a number of reasons. And also because historically we have a lot 
of data, you know, from the rat. And so there’s real value there and the 
real  stumbling  block  of  not  being  able  to  genetically  modify,  you  know, 
this critical tool has been a real challenge. 
Dr. Carl Lupica:  We  were  mentioning  previously  in  all  off‐air  discussions  the  pig  as  a 
potentially  interesting  model  as  well,  certainly  from  an  agriculturist’s 
perspective.  But  more  from  the  healthcare  perspective  because  the  pig 
organs have historically been some of the least rejected in humans, in pig 
valves  for  examples  in  heart.  And  so,  I  think,  there  are  a  number  of 
initiatives to further what we can be done there genetically. 
Sean Sanders:  And  I’m  guessing  that  cost  is  also  a  consideration,  housing  animals  of 
different sizes and ‐‐ I don’t know if somebody asked about a comparison 
between rats and mice, are you looking at a sort of a 2:1 ratio, 3:1? Is it a 
lot more expensive for large animals? 
Dr. Rosalba Sacca:  It is more expensive and they are larger so you need more space ‐‐  
Sean Sanders:  Right. 
Dr. Rosalba Sacca:  ‐‐ to accommodate them. Yeah. So, I would guess that at 2:1 probably. 
Sean Sanders  All  right.  Great.  And  then  we  come  back  to  you  Dr.  Sacca.  There’s  a 
question  from  your  presentation  about  the  humanized  mouse.  Why  are 
the stem cells injected into the liver? 
Dr. Rosalba Sacca:  Oh, that’s the ‐‐ that’s right. That’s the hepatotox. So, yes, because they 
can actually ‐‐ you know, it’s one quick way of them being able to actually 
have the necessary environment to do well and proliferate in that space. 
So, we’ve been able to show that you can put hepatocytes right into the 
liver.  And,  you  know,  a  percentage  of  them,  around  20%  with  some 
variability  here  and  there,  will  actually  become  incorporated  into  that 
organ  so  that  you  establish  a  chimeric  organ  with  both  mouse  cells  and 
human cells. 
Sean Sanders:  Uh‐hum. 
Dr. Kerry Ressler:  I  have  a  question  thinking  about  some  of  this  especially  the  Zinc  Finger 
technology.  Have  you  heard  ‐‐  has  it  been  brought  up  in  terms  of  gene 
therapy approaches yet? Because one of the questions with a number of 
disorders  where  you  have  a  specific  mutant  would  be,  could  you  isolate 
progenitor  cells  from  the  patient  do  ex  vivo  manipulations,  not  just 
transgenic but now you can potentially target that mutant gene, replace 
it, and then put it back in. Is that ‐‐ are people talking about that? 
Dr. Rosalba Sacca:  Yeah.  So,  I’m  not  an  expert  on  it,  but  I  know  that  one  of  the  Zinc Finger 
protein  that  Sangamo  had  generated  is  in  the  clinic.  I  think  it’s  a  VEGF 
Dr. Kerry Ressler:  I see. 
Dr. Rosalba Sacca:  Yeah. And so again, it has to do with, you know, the circulatory system. I 
don’t know what the results are or how far along it is, but I know that it 
was being tested in the clinic. 
Sean Sanders:  Right.  Well,  we’re  coming  to  the  end  of  our  hour  so  I’m  going  to  throw 
out  a  final  question  to  all  three  of  you  from  one  of  our  viewers.  They 
asked, in which areas of research to you see the greatest opportunity for 
breakthroughs  now  that  other  knockout  and  knock‐in  models  are  more 
easily ‐‐ more easy to make? So, again, where is the greatest need do you 
see? So, why don’t we start with Dr. Ressler and work our way down. 
Dr. Kerry Ressler:  Well ‐‐ and I’m not basically biased, but I think ‐‐ 
Dr. Rosalba Sacca:  [Laughs] 
Dr. Kerry Ressler:  But I think ‐‐ 
Dr. Carl Lupica:  I’m sure you’re biased. 
Dr. Kerry Ressler:  I think the great diversity of cell types and region specific function within 
the  brain  certainly  opens  up  the  CNS  approaches  for  the  areas  that  we 
could  maybe  make  the  largest  and  fastest  approaches  with  new 
technologies.  Although,  I’m  really  excited  potentially  also  about  this 
clinical approach as well to be able to target genetic disorders in humans 
Sean Sanders:  Dr. Sacca? 
Dr. Rosalba Sacca:  So,  I’m  excited  about  the  humanized  system,  especially,  you  know,  our 
ability  to  humanize  the  immune  system  of  these  mice.  Because  a  lot  of 
times,  you  know,  the  effects  that  we  see  are  still  in  the  context  of  a 
mouse’s immune system. So, I know that there’s a lot of work out there 
and  I  know  we’re  not  there  yet.  But  I  see  that  as  really  ‐‐  you  know, 
having  that  tool  available  to  everyone,  I  think,  could  make  some 
significant progress in the kinds of things that we’re interested in. 
Sean Sanders:  Uh‐hum. Dr. Lupica? 
Dr. Carl Lupica:  Well, I think they’ve answered the question very well. 
  I’ll  take  a  stab.  I’m  also  biased  because  I’m  a  neurobiologist  and  I  study 
addiction  and  also  neurodegenerative  disorders.  I  see  great  promise  for 
transgenic  technologies  in  addressing  especially  neurodegenerative 
disorders  because  we  can  now  model  some  of  these  neurodegenerative 
diseases in transgenic animals.  
  And  in  the  case  of  Parkinson’s  disease  for  example,  we  can  do  so  by 
avoiding  some  of  the  drawbacks  that  were  inherent  in  previous 
technologies  such  using  neurotoxins.  So,  I  think,  the  next  decades  we’ll 
see great advances in that area.  
  And,  of  course,  the  technology  itself  is  advancing  at  such  a  rapid  pace 
that  I  see  it  impacting  many  different  areas  including  the  area  of 
addiction.  So,  I  think,  the  future  holds  great  promise  in  general  for 
neuroscience with the use of genetically engineered animals. 
Sean Sanders:  Great. All very exciting. I look forward to seeing a lot of work out of your 
Slide 49 
  So,  unfortunately,  we  are  out  of  time  for  this  webinar.  I’d  like  to  thank 
our  panelists  once  again  for  being  with  us  today  and  for  generously 
sharing  their  knowledge  and  expertise:  Dr.  Carl  Lupica  from  NIH,  Dr. 
Rosalba Sacca from Pfizer, and Dr. Kerry Ressler from Emory University.  
  Thanks again to you all for being with us today. I appreciate you being in 
the studio. 
Dr. Kerry Ressler:  Thank you. 
Dr. Rosalba Sacca:  Thank you, Sean. 
Dr. Carl Lupica:  Thanks, Sean. 
Sean Sanders:  And thank you to our viewers for the questions you submitted. Apologies 
if we didn’t have time to get to yours.  
  Please  go  to  the  URL  at  the  bottom  of  your  slide  viewer  now  to  learn 
more about products related to today’s discussion and look out for more 
webinars  from  Science  available  at
.  This 
webinar  will  be  made  to  view  again  as  an  on‐demand  video  within 
approximately 48 hours from now.  
  Please  share  your  thoughts  with  us  about  the  webinar  at  any  time  by 
sending  an  email  to  the  address  now  up  in  your  slide  viewer;
  Again,  thank  you  to  our  panel  and  to  Sigma  Advanced  Genetic 
Engineering  Labs  for  their  kind  sponsorship  of  today’s  educational 
[1:02:40]  End of Audio