Rapport du PRI « Biocarburant-éthanol » - Les Dossiers du Net

intimidatedunadvisedBiotechnology

Feb 19, 2013 (4 years and 4 months ago)

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Rapport du PRI « Biocarburant-éthanol »
Objectifs scientifiques
L’éthanol carburant est un additif des essences soit directement soit sous forme de dérivés
oxygénés renforçant les propriétés antidétonantes. La levure Saccharomyces cerevisiae,
présentant les meilleurs atouts génétiques et métaboliques, a été choisie pour cette étude qui
participe d’un programme interactif conduit conjointement par plusieurs équipes de
recherche. La compréhension et, conséquemment, la maîtrise du comportement physiologique
de la levure en condition de forte teneur en éthanol (supérieure à 15%) devra permettre, à
terme, de sélectionner une levure très performante pour la production d’éthanol,
particulièrement résistante à des taux élevés d’alcool et capable de croître rapidement.
Stratégies de recherche
Volet 1 : Bases méthodologiques et stratégiques de la production de bioéthanol sur
substrats non conventionnels. Coordinateur du projet : J-P Belaich UPR 9036
Bioénergétique et ingénierie des protéines (BIP) Marseille
Le but de cette opération consiste en la mise au point d’une stratégie enzymatique pour l’hydrolyse et
la fermentation de substrats non conventionnels. Ce rapport présente le résultats obtenus gràce à la
collaboration de deux équipes qui se sont impliquées dans cette action (M. Asther INRA et J-P Bélaich
CNRS).
L’objectif de cette étude est de mettre au point un procédé enzymatique performant pour la
biotranformation des lignocelluloses, afin de libérer à partir de la biomasse végétale des sucres
fermentescibles en bioéthanol.
Dans ce contexte, les microorganismes représentent un potentiel exceptionnel comme source
d’enzymes et/ou comme moyen de production à l’échelle pilote des enzymes recherchées. La
complexité structurale des parois végétales et l’hétérogénéité des polysaccharides qui les composent
font que de multiples enzymes, de spécificité différente, sont synthétisées par les micro-organismes
lignocellulolytiques qui les dégradent. Ces enzymes agissent en synergie pour liquéfier la cellulose.
Les bactéries cellulolytiques ont développé des systèmes enzymatiques très performants qui leur
permettent de croître sur cellulose cristalline. Les champignons basidiomycètes sont reconnus pour
être les micro-organismes eucaryotes les mieux adaptés pour la dégradation de la lignine pariétale
grâce aux laccases qu’ils synthétisent. D’autres enzymes microbiennes d’origine eucaryote ou
procaryote comme les estérases produites par Aspergillus niger (féruloyl, cinnamoyl estérases)
participent à l’hydrolyse des liaisons esters entre les groupements phénoliques des acides cinnamiques
(liés de façon covalente à la lignine) et les polysaccharides des parois (cellulose, hémicellulose et
pectine). L’action de ces deux catégories d’enzymes, qui ont été récemment définis comme enzymes
“ helper ” faciliterait ainsi l’accès des cellulases à leurs substrats naturels.

Deux parties différentes seront considérées dans ce rapport. La première a trait à la mise en œuvre des
enzymes cellulolytiques et des enzymes “ helper ”, la seconde concerne les techniques de production
en masse, à un coût industriellement acceptable, de ces enzymes. Les enzymes utilisées dans le cadre
de cette recherche ont été produites et préparées par les techniques de l’ingénierie génétique. Ce
rapport est trop court pour que ces préparations puissent être décrites. Elles se trouvent dans la
bibliographie citée.


1) Mise en œuvre des enzymes cellulolytiques et des enzymes “ helper ”
Nous avons choisi de faire porter notre effort sur les enzymes qui font partie des systèmes
cellulolytiques les plus performants , les cellulosomes, synthétisés par un certain nombre d’espèces de
bactéries cellulolytiques anaérobies. Dans les cellulosomes les cellulases sont adsorbées sur une
protéine charpentière ce qui facilite considérablement leurs synergies d’action, cela avait été démontré
par notre équipe avant le début de cette action. Deux cellulases CelF et CelG provenant du
cellulosome de la clostridie Clostridium cellulolyticum ont été associées à une enzyme “ helper ” xynZ
bifonctionnelle, contenant deux domaines catalytiques, un domaine xylanase et un domaine féruloyl
estérase, pour hydrolyser une suspension de paille de blé simplement broyée et lavée. Les résultats
obtenus ont été spectaculaires. Il sont rapportés sur la figure située en fin du rapport. On constate tout
d’abord une légère synergie entre les 3 enzymes libres, non associées. Bien plus leur association en un
mini-cellulosome à 3 partenaires augmente considérablement l’hydrolyse de la paille. Ce résultat
conforte les résultats précédemment obtenus dans le cas des études sur les synergies d’action des
cellulases montrant que l’intégration des cellulases dans un cellulosome favorisait fortement les
synergies. Par contre, le mini-cellulosome reconstitué contenant les 3 enzymes est nettement moins
actif que les cellulosomes naturels de C. cellulolyticum qui contiennent 8 enzymes. Il convient de
souligner ici que les cellulosomes naturels sont en réalité une population de cellulosomes dont chaque
élément contient 8 enzymes Ils ne sont cependant pas tous identiques si l’on considère leur
composition enzymatique. Il est a présent impossible avec les techniques actuelles de la biochimie de
purifier des cellulosomes de composition unique.

Les champignons filamenteux synthétisent des systèmes cellulolytiques constitués de glycosides
hydrolases et d’estérases qui n’ont aucune interaction structurale. Ces enzymes relarguées par les
cellules sont libres dans le milieu extra-cellulaire et agissent en synergie. Le système le plus étudié est
sans conteste celui de Trichoderma reesei qui contient deux exo-cellulases, CBH1 et CBH2 et au
moins 4 endo-glucanases EG1, EG2, EG3 et EG5. Ces enzymes peuvent être produites
industriellement, cependant dans la majeure partie des cas, lorsqu’on parle de cellulases industrielles
de T. reesei il s’agit d’un surnageant de culture brut qui contient les cellulases et bien d’autres
protéines de fonction inconnue. Nous avons voulu comparer l’activité des différentes combinaisons de
glycosides hydrolases cellulosomiales avec celle du système de T. reesei qui est actuellement présenté,
par ses développeurs industriels, comme le plus performant. Le résultat de la comparaison est montré
sur la figure1. On voit que, pour une même concentration en protéines actives (0,032 mg/ml), l’activité
du système cellulase brut de T. reesei est légèrement supérieure à celle du mini-cellulosome
reconstitué à 3 enzymes mais nettement inférieure à celle du cellulosome natif. Cette comparaison doit
être tempérée par le fait que les cellulosomes ont été mis en jeu à 37°C, température imposée la nature
de leurs constituants qui provenaient en majorité de C. cellulolyticum , bactérie mésophile, alors que
l’expérience réalisé avec les enzymes de T. reesei a été faite à 45°C, température optimum pour ce
système. En tenant compte de l’écart de température on peut considérer que le minicellulosome à 3
enzymes est aussi efficace que le surnageant brut de T. reesei

Enfin un troisième type d’enzyme helper, provenant de la bactérie cellulolytique Clostridium
cellulolyticum a été étudiée. Il s’agit d’une rhamnogalacturonane lyase qui est une composante du
cellulosome de cette bactérie cellulolytique. Cette enzyme est une pectinase qui clive les liaisons
glycosidique du rhamnogalacturonane I et agit par béta-élimination.

En conclusion de cette première partie on peut affirmer que les enzymes de T. reesei ne présentent pas
un avantage catalytique déterminant sur celles qui proviennent des bactéries mésophiles. Considérant
maintenant les bactéries thermophiles comme par exemple Clostridium thermocellum dont les
enzymes fonctionnent à 65° on peut espérer un accroissement des vitesses d’hydrolyse de la paille par
un facteur 4 ce qui rendrait ces systèmes nettement plus performants que les systèmes fongiques.
L’avantage scientifique du travail sur les systèmes bactériens consiste en la connaissance précise des
systèmes reconstitués grâce aux techniques de l’ingénierie génétique.


2) Production en masse des meilleurs systèmes enzymatiques
Les synergies d’action entre cellulases et enzymes helper étant stimulées par l’organisation des
enzymes en cellulosomes nous avons tenté de fusionner, à des enzymes fongiques (par manipulation
génétique) les domaines protéiques (cohésines et dockérines) nécessaires à l’assemblage des
cellulosomes. La fusion des gènes n’a posé aucun problème particulier. Cependant l’expression de ces
gènes fusionnés dans l’hôte fongique choisi, Aspergillus niger, n’a pas été obtenue quoique un résultat
préliminaire nous ait montré que cette expression ne semblait pas impossible à condition d’y consacrer
des moyens incomparablement plus importants que ceux dont nous disposions dans le cas de cette
étude.
Nous avons alors développé une recherche visant à mettre au point un procédé de production
d’enzymes helper fongiques enzymes pouvant être transposé directement de l’échelle laboratoire à
l’échelle pilote. Le cDNA de la laccase du champignon Pycnoporus cinnabarinus a été placé sous le
contrôle du promoteur du gène de l'alcool oxydase (Aox1) et du gène de la glycéraldehyde-3-
phosphate déshydrogénase (gpdA) pour l’exprimer respectivement chez la levure Pichia pastoris et le
champignon A. niger. La sécrétion de la protéine a été optimale avec les peptides signaux hétérologues
(peptide signal du facteur sexuel de la levure et de la glucoamylase d’A. niger). Les activités atteintes
à 10/12 jours sont respectivement de 50 et 7000 U.I./l, avec une masse moléculaire respectivement de
110 et 70 kDa pour la levure et A. niger, contre 70 kDa pour la protéine sauvage, suggérant la
présence d'hyperglycosylation pour la laccase produite par P pastoris. Ces résultats correspondent à
une production de 8 et 70 mg/l de laccase pour P. pastoris et A. niger. Cette protéine recombinante est
produite majoritairement dans le surnageant de culture d’A. niger et peut être purifiée en une seule
étape sur DEAE-Sépharose. Les caractéristiques physico-chimiques de la laccase recombinante sont
identiques à celles de la protéine sauvage. Ces résultats nous ont encouragé à poursuivre dans la voie
de la surexpression chez les Aspergilli pour la production d’autres enzymes.La féruloyl estérase
(faeIII) d’A. niger a été surexprimée en utilisant le peptide signal de FAE III (surexpression
homologue) et le promoteur du gène gpdA. La protéine recombinante est purifiée en une étape sur
phényl-sépharose et nous avons estimé la production à 1 g/l de FAE. Le niveau de production nous
permet donc d’envisager directement une utilisation de l’enzyme à l’échelle industrielle.

Cinétiques de dégradation de la paille non traitée par les différents systèmes enzymatiques


Légende : Dans tous les cas la concentration d’enzymes est identique et égale à 0,032 mg/ml. Il en est
de même pour la concentration en paille de blé non traitée qui est de 3,5 mg/ml.
1: action des enzymes libre CelF et CelG (F et G)de C. cellulolyticum
2: Action de XynZ (Z)de C. thermocellum
3: Action du mélange d’enzymes libres CelF, CelG, et Xyn Z
4: Action des enzymes CelF, CelG, et Xyn Z structurées en un cellulosome à 3 partenaires.
5: Action du système cellulolytique brut de T. reesei
6: Action de la population de cellulosomes natifs de C. cellulolyticum

3) Conclusions et Prospectives.
Les principaux résultats de cette étude montrent que l’organisation des enzymes les plus performantes
en cellulosomes bien définis et adaptables au type de lignocellulose (paille, peuplier, eucalyptus…) à
liquéfier est possible. La possibilité de synthétiser de cellulosomes thermostables à partir de
constituants provenant de clostridies thermophiles comme C. thermocellum ou Clostridium
stercorarium est intéressante dans la mesure ou les vitesses d’hydrolyse pourraient être accrues par un
facteur 3 ou 4 par rapport au système enzymatique brut de T. reesei.
La production en grande quantité de protéines chimères dans des hôtes fongiques est actuellement le
facteur limitant pour envisager une production industrielle des cellulosomes à partir de ces
organismes. Une solution de production par des bactéries reposant sur l’utilisation des différentes
espèces de Bacillus utilisées industriellement pourrait être envisagée.
La simplicité des cellulosomes et le fait de pouvoir les adapter par ingénierie moléculaire aux
différents subtrats lignocellulosiques d’intérêt permet d’envisager leur synthèse par la levure
Saccharomyces cerevisiae ce qui permettrait de faire fermenter directement la cellulose en éthanol.
Des pistes de recherche ce type sont envisagées au Japon (8 millions de dollars sont actuellement
consentis pour des projet visant à rendre la levure cellulolytique). Nous avons également commencé
depuis deux ans, en collaboration avec un laboratoire d’Afrique du Sud, une recherche visant à
introduire les enzymes CelF et CelG du cellulosome de C. cellulolyticum dans la levure où elles seront
positionnées sur la face extérieure de la paroi.
Les succès obtenus dans le cadre de la surexpression des gènes homologues dans les champignons
filamenteux pourraient conduire à l’enrichissement des surnageants (boites noires) de T. reesei par des
enzymes helper fongiques susceptibles d’améliorer les performances cellulolytiques de ces
surnageants.
Enfin il pourrait être envisagé de compléter les surnageants de T.reesei par des enzymes helper ou des
cellulases non présentes dans cette espèce, d’origine eucaryote ou procaryote, produites séparément à
partir des organismes les plus performants.

4) Références.
Pour en savoir plus sur la construction de cellulosomes:
1) Fierobe HP, Mechaly A, Tardif C, Belaich A, Lamed R, Shoham Y, Belaich JP, Bayer EA. Design
and production of active cellulosome chimeras. Selective incorporation of dockerin-containing
enzymes into defined functional complexes. J Biol Chem. 2001
2) Fierobe HP, Bayer EA, Tardif C, Czjzek M, Mechaly A, Belaich A, Lamed R, Shoham Y, Belaich
JP. Degradation of cellulose substrates by cellulosome chimeras. Substrate targeting versus proximity
of enzyme components. J Biol Chem. 2002 Dec 20;277(51):49621-304:

Publications réalisées pendant la durée du contrat :

1) Pages S, Valette O, Abdou L, Belaich A, Belaich JP. A rhamnogalacturonan lyase in the
Clostridium cellulolyticum cellulosome. J Bacteriol. 2003 Aug;185(16):4727-33.

2)Record E, Asther M, Sigoillot C, Pages S, Punt PJ, Delattre M, Haon M, van den Hondel CA,
Sigoillot JC, Lesage-Meessen L, Asther M. Overproduction of the Aspergillus niger feruloyl esterase
for pulp bleaching application. Appl Microbiol Biotechnol. 2003
3) Record E., Asther M., Sigoillot C., Pagès S., Punt P. J., Delattre M., Haon M., van den Hondel
C.A..M.J.J., Sigoillot J.C., Lesage-Meessen

L., Asther M. 2003 Overproduction of the Aspergillus
niger feruloyl esterase for pulp bleaching application.Applied Microbiology and Biotechnology Appl
Microbiol Biotechnol. 2003
4) Perret S, Casalot L, Fierobe HP, Tardif C, Sabathe F, Belaich JP, Belaich A. Production of
heterologous and chimeric scaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 824. J Bacteriol.
2004 Jan;186(1):253-7.
5) LEVASSEUR A., BENOIT I., ASTHER M., ASTHER M., RECORD E. 2004
Homologous expression of the feruloyl esterase B gene from Aspergillus niger and
characterization of the recombinant enzyme Protein, Expression and Purification (in press)
6) LEVASSEUR A., ASTHER M., RECORD E. 2004 Overproduction and characterization of the
xylanase Xyn2 from Aspergillus niger Canadian Journal of Microbiology (submitted)
7)ANTHONY LEVASSEUR, SANDRINE PAGÈS, HENRI-PIERRE FIEROBE, DAVID
NAVARRO,PETER PUNT, JEAN-PIERRE BELAÏCH, MARCEL ASTHER AND ERIC RECORD
2004.Design and production in Aspergillus niger of a chimeric protein associatinga fungal feruloyl
esterase and a clostridial dockerin domain AEM in Press

Volet 2 : Bases moléculaires et dynamiques pour l’ingénierie métabolique de levures
performantes pour la production d’ethanol-carburant. Coordinateur du projet : J.M.
François UMR 5504 Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés, Toulouse
1- Rappel du contexte :


La levure Saccharomyces cerevisiae est l’organisme qui présente par rapport à d’autres
levures ou bactéries, les meilleurs atouts génétiques et métaboliques pour répondre à ce
double objectif. Cependant, atteindre cet objectif exige avant tout de comprendre, et de
maîtriser le comportement physiologique de la levure en condition de forte teneur en éthanol.
Ceci suppose d’engager plusieurs actions de recherche qui peuvent être résumées selon les
deux grandes lignes directrices suivantes.
a) Quantifier l’efficacité métabolique fermentaire. Ceci comprend l’analyse des flux
métaboliques, de l’état énergétique et de la balance rédox de la levure au cours de la
fermentation, de l’efficacité du découplage entre production d’éthanol et croissance, et
aussi de quantifier l’effet inhibiteur de la fermentation alcoolique par l’éthanol
(inhibition par le produit) (contribution M. Rigoulet et al., IBCG, Bordeaux)
b) Identifier les cibles moléculaires impliquées dans l’adaptation de la levure à de fortes
teneurs en éthanol (>15%). La résistance à l’éthanol peut être soit ‘acquise’ ou
induite. On devrait pouvoir mettre en évidence ces cibles par une approche de
génomique globale, et la confirmer par des méthodes protéomiques et métaboliques
(Contribution JM François, INSA-Toulouse, S. Dequin, INRA-Montpellier et M.
Jacquet, Orsay-Paris).
Bien que ces questions aient déjà été posées dans le passé, la connaissance du génome de la
levure, la disponibilité d’outils nouveaux plus performants de technologies post-génomiques
(puces à ADN, RMN in vivo, microcalorimétrie, etc) et la volonté de travailler en réseau en
faisant interagir plusieurs équipes françaises compétentes et complémentaires sont autant
d’atouts pour résoudre ces questions et envisager de construire une levure hyper performante
pour la production et la résistance à l’éthanol.



A) Optimisation de la croissance et de la capacité fermentaire chez une levure
Saccharomyces cerevisiae résistante à l’éthanol. (M. Rigoulet, Laboratoire d’étude du
métabolisme énergétique cellulaire, UMR 5095, Bordeaux).

Ce projet s’inscrit dans un programme intégré et spécifique dont le but est de définir “les
bases moléculaires et dynamiques de l’ingéniérie métabolique et physiologique d’une levure
performante pour la production d’éthanol”. Cet objectif a été défini à l’intérieur d’un Groupe
d’Action Thématique du CNRS, « biomasse pour l’énergie » et « biocarburant éthanol ». L’
éthanol carburant est un additif des essences soit directement soit sous forme de dérivés
oxygénés renforçant les propriétés antidétonantes. La levure Saccharomyces cerevisiae,
présentant les meilleurs atouts génétiques et métaboliques, a été choisie pour cette étude qui
participera d’un programme interactif conduit conjointement par quatre équipes de recherche.
La compréhension et, conséquemment, la maîtrise du comportement physiologique de la
levure en condition de forte teneur en éthanol (supérieure à 15%) devra permettre, à terme, de
sélectionner une levure très performante pour la production d’éthanol, particulièrement
résistante à des taux élevés d’alcool et capable de croître rapidement. Dans ce projet général,
la participation de notre groupe devra concerner deux volets :

1) Optimisation de la croissance aérobie des levures

La croissance aérobie des levures dépend essentiellement de leur capacité respiratoire, elle-
même strictement corrélée à la quantité de mitochondries par cellule. Il est maintenant prouvé
que le contenu des cellules en mitochondries est un élément clé de l’homéostasie cellulaire,
permettant de répondre à de larges variations en besoins énergétiques. Sa régulation nécessite
l’expression coordonnée de plusieurs centaines de gènes nucléaires et mitochondriaux. Nous
avons entrepris de développer, en collaboration avec le groupe de Claude Jacq (ENS, Paris),
une approche génomique globale afin de caractériser les différents groupes de gènes
impliqués dans les réponses transcriptionnelles lors de l’induction de la biogenèse
mitochondriale. L’identification des voies de signalisation gouvernant cette biogenèse
pourrait fournir des outils nouveaux pour le développement de notre projet. Néanmoins, les
premières observations faites dans le laboratoire constituent une base solide permettant
d’initier le premier volet de notre étude qui est d’améliorer la vitesse de croissance cellulaire.
Nous disposons d’une souche dans laquelle l’expression de la sous-unité  de la F1-F0-
ATPsynthase mitochondriale peut être contrôlée par simple addition de doxycycline dans le
milieu de culture (utilisation d’un promoteur sensible à la doxycycline). Une déplétion
partielle en sous-unité  conduit à la formation d’un certain nombre d’ATPsynthases
dépourvues de cette sous-unité et ainsi rendues perméables aux protons. Dans ces conditions
de faible découplage des oxydations phosphorylantes, nous avons pu observer une forte
augmentation de la vitesse de la respiration maximale associée à un doublement du contenu
en cytochromes et à un accroissement de la masse mitochondriale. Ceci permet une nette
amélioration de la vitesse de multiplication des levures. Nous nous proposons d’utiliser ce
système qui permet de bien maîtriser la cinétique d’induction de la biogenèse mitochondriale
pour essayer de définir les conditions optimale de croissance. Pour cela, nous étudierons
systématiquement les conséquences sur la croissance et sur l’équipement mitochondrial de
différents degrés de découplage. Bien sûr, ce travail sera mené en utilisant les souches
particulièrement résistantes à l’éthanol qui sont en voie de sélection dans le groupe du
Professeur J.M. François. Enfin, les résultats de l’analyse globale de l’expression du génome,
lors de l’induction de la biogenèse mitochondriale, pourraient conduire à l’identification de
gènes-cibles permettant de définir une nouvelle stratégie de contrôle de la biogenèse de ces

organites. Ces données seront prises en compte dans le processus général de sélection de la
souche.

2) L’état énergétique cellulaire et l’amélioration de la production d’éthanol

Afin d’optimiser l’efficacité fermentaire d’une levure, il convient tout d’abord de faire une
analyse des flux métaboliques, de l’état énergétique et de la balance rédox, de décrire les
mécanismes de régulation gouvernant la relation production d’éthanol / production de
biomasse et aussi de caractériser l’effet inhibiteur de la fermentation alcoolique par l’éthanol.
Un des sous-produits majeurs de la fermentation est le glycérol. La balance entre production
de glycérol et d’éthanol lors de la fermentation dépend de plusieurs facteurs dont l’un des
principaux est l’état rédox des cellules. Plus le pool de NAD
+
sera réduit, plus le flux de
formation du glycérol aura tendance à augmenter. On peut essayer de modifier cet état et, en
particulier, de générer des potentiels plus oxydés soit en agissant sur l’équipement
enzymatique des différentes voies, soit en tentant d’imposer un état rédox favorable à la
fermentation alcoolique au détriment de la voie glycérol. Ceci peut être la conséquence de
l’introduction dans les cellules d’un système actif de réoxydation du NADH indépendant de la
fermentation elle-même. Si l’impact de la manipulation de l’état rédox est théoriquement
déterminant on peut aussi supposer qu’une augmentation de la consommation d’ATP
(création de cycles futiles par exemple) ou une introduction d’un léger découplage
favoriserait aussi le drainage du flux métabolique vers l’éthanol. Enfin, on peut aussi agir sur
le flux de la glycolyse elle-même en modifiant l’équipement enzymatique et en diminuant
ainsi les contraintes cinétiques de ce réseau métabolique. Ces pistes, théoriquement justifiées,
devront être systématiquement explorées. Il conviendra cependant de mener une approche pas
à pas : en effet, il pourrait apparaître des incompatibilités sérieuses dues aux différents
objectifs que nous nous proposons (amélioration de la vitesse de multiplication des cellules,
résistance à de fortes teneurs en éthanol, augmentation et orientation du flux fermentaire).
Dans ce cas, nous rechercherons le meilleur compromis possible.

B) Base moléculaire et dynamique de l’ingénierie métabolique et physiologique de la
levure performante pour la production de bioéthanol carburant
B.1. Analyse génomique de la dynamique d’adaptation de Saccharomyces cerevisiae à des
fortes productions d’éthanol (Contribution M.Cot, Jean M François, S. Guillouet et L.
Benbadis, INSA-UMR-CNRS 5504 Toulouse)


Dans le cadre des procédés biotechnologiques de production de biomolécules (comme
l’éthanol pour la production de « bio-éthanol »), l’intégration de la génomique fonctionnelle
en tant qu’outil d’investigation complémentaire aux techniques classiques de génie
microbiologique et de physiologie est nécessaire pour une avancée rapide dans la
compréhension et l’identification :
- des phénomènes entraînant les inhibitions, toxicités et létalité
- les processus moléculaires influençant la croissance, viabilité, mortalité et
productivité des microorganismes
- les réponses moléculaires des microorganismes à l’environnement physico-
chimique en cours de procédé.
Ces problématiques constituent les verrous scientifiques et technologiques qui limitent les
performances actuelles industrielles de production de biomolécules. Ces verrous ne pourront
être levés que si on arrive à réconcilier les données macrocinétiques et microscopiques
aux données moléculaires obtenues par la génomique fonctionnelle.

Notre approche de compréhension du stress éthanol se distingue des études trouvées dans la
littérature par le fait que nous analysons l’adaptation des levures à des fortes concentrations
en éthanol produit lui-même par le microorganisme au cours de la fermentation en condition
de production industrielle, alors que les travaux antérieurs se sont intéressés à l’effet ‘choc
éthanol’.
L’originalité scientifique de ce programme de recherche réside dans l’association de
compétences des biologistes (physiologistes et généticiens) et des ingénieurs des procédés
(génie microbien), de l’automatisme et de la modélisation :
- le génie microbien permet la mise en œuvre contrôlée des microorganismes, par la
maîtrise des paramètres nutritionnels, physico-chimiques (pH, température,
oxygénation, rhéologie…) et du mode de culture (culture discontinu, semi-continu,
chemostat, bioréacteur à membrane) aidant à l’identification et la maîtrise des états
physiologiques des organismes étudiés
- la biologie aide à l’analyse du comportement cellulaire à l’échelle microscopique
et moléculaire

Nous avons mis au point un stratégie de fermentation alcoolique qui a conduit à 125 à 147 g/L
d’éthanol (15% à 19 % v/v) en 45h selon le mode d’apport des vitamines (Alfenore et al.,
2002). Nous avons démontré également que la stratégie d’aération comme la stratégie
nutritionnelle utilisée (apport des vitamines) est un facteur déterminant pour atteindre des
performances en terme de production d’éthanol (147 g l
-1
en 45h) et définir ainsi un procédé
dynamique très compétitif (Alfenore et al., 2003).
Notre objectif est de caractériser le mécanisme de tolérance des levures à l’éthanol, de
rechercher une stratégie pertinente pour améliorer la résistance à la toxicité causée par
l’éthanol et d’améliorer la performance de production de ce métabolite (productivité). Notre
approche consiste à obtenir des informations quantitatives aux trois niveaux d’observations :
macroscopique (concentrations, vitesses spécifiques…), microscopique (viabilité,
morphologie) et moléculaire (profils d’expressions transcriptomiques, métabolites produits..).
Nous rapportons les résultats des profils d’expression globale des gènes de la levure au cours
de son adaptation à sa propre production en éthanol lors d‘une fermentation en mode fed-
batch avec un apport contrôlé de glucose couplé à la croissance (ajout de base) qui a conduit
à 125 g/L d’éthanol en 50 heures à 30°C (cf. fig 1).



Figure1 : Evolution de la concentration en biomasse, éthanol, glucose et viabilité (coloration au bleu de
méthylène) au cours de la fermentation alcoolique de S. cerevisiae en mode fed-batch.

Pour l’étude du transcriptome, nous avons produit des lames de levure sur un support
spécialement conçu par la plateforme transcriptome-Biopuces du Génopole de Toulouse (les
Dendrichips, [Leberre V et al., 2003]) qui porte 6200 fragments PCR en duplica
correspondant aux 6200 gènes de la levure S. cerevisiae. Nous avons effectué une étude
d’expression globale au cours du temps de la croissance, en utilisant comme référentiel
l’échantillon 1, qui correspond à la phase de croissance ("=0,3) de la levure sur glucose,
quand l’effet ‘inhibition par l’éthanol’ est absent (17 g/L d’éthanol). Les ARN messagers de
ces échantillons ont été extraits et marqués avec le fluorochrome CY3 (vert) et sont hybridés
avec échantillons 2 à 6 (marquage au Cy5). Nous parlerons de gènes sous ou sur exprimés par
rapport à cette référence. Les expériences sont répétées 3 fois afin d’appliquer un test de
Student. Seuls sont jugés significativement différents les gènes dont la probabilité associée est
inférieure à 5% (Fig 2).

Viability
Biomass g l
-1
Glucose g l
-1
Ethanol g l
-1
Biomass
Ethanol
Glucose
Viabilty
Viabilité
Viabilit
Biomasse
g l
-1
Glucose g l
-1
Glucose g l
-1
Ethanol g l
-1
Biomasse
Ethanol
Glucose
Viabilité
heures
Viability
Viability
Biomass g l
-1
Glucose g l
-1
Glucose g l
-1
Ethanol g l
-1
Biomass
Ethanol
Glucose
Viabilty
Viabilité
Viabilit
Biomasse
g l
-1
Glucose g l
-1
Glucose g l
-1
Ethanol g l
-1
Biomasse
Ethanol
Glucose
Viabilité
heures
Reference
90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
[Ethanol]=
ethanolproduction rate
Reference
90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
[Ethanol]=
ethanolproduction rate
viabilité
ORFs sur-
exprimés
ORFs sous-
exprimés
Arrêt de
croissance

Reference
90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
[Ethanol]=
ethanolproduction rate
Reference
90, 95, 100 g l
-1
17 g l
-1
65 g l
-1
125 g l
-1
[Ethanol]=
ethanolproduction rate
viabilité
ORFs sur-
exprimés
ORFs sous-
exprimés
Arrêt de
croissance
ORFs sur-
exprimés
ORFs sous-
exprimés
ORFs sur-
exprimés
ORFs sous-
exprimés
Arrêt de
croissance


Figure 2 : Changement d’expression des gènes au cours de la fermentation alcoolique de S. cerevisiae
en mode fed-batch.
Analyse globale du profil d’expression des gènes
Nous observons deux phases au cours de la fermentation. La phase 1 caractérisée par
une croissance et une production d’éthanol concomitante et une seconde phase (phase
2) où la croissance s’arrête mais les cellules continuent de produire de l’éthanol (phase
de découplage). On peut observer une chute progressive de la viabilité dans la phase
de découplage après l’arrêt de la croissance (cf. fig. 2). Les résultats de changement
d’expression des gènes montrent un nombre important de gènes sous-exprimés et sur-
exprimés tout au long de la fermentation (cf. histogrammes de la figure 2). En
choisissant un seuil de moins de 0,55 pour les gènes sous-exprimés et plus de 1,8 pour
les gènes sur-exprimés (avec une P-value de moins de 5%), nous observons au
alentour de 200 gènes réprimés dès l’échantillon 2. Ce nombre reste constant pour tous
les échantillons analysées. Concernant les gènes sur-exprimés, peu de gènes sont
induits à l’échantillon 2 (phase de croissance et de production d’éthanol
concomitante ; concentration en éthanol de 65 g/L), puis plus de 350 gènes sont
induits après l’arrêt de la croissance et ce nombre diminue à 225 à l’échantillon 6
(levure en conditions extrêmes à 125 g/L).
Gènes sous-exprimés
Une classification à été réalisée sur les gènes sous-exprimés et a permis
l’identification du changement d’expression d’un groupe de gènes qui caractérise le
déclin de la croissance et concerne la répression de gènes impliqués dans la synthèse
protéique (cf. fig 3), la transcription et la traduction.



Figure 3 : profil de sous-expression de gènes impliqués dans la synthèse protéique

Gènes dont l’expression est affectée au cours de la fermentation alcoolique
Un groupe de gènes régulés dans nos conditions d’adaptation des levures à des fortes
concentrations en éthanol produit lui-même par le microorganisme au cours de la
fermentation sont les gènes impliqués dans le métabolisme rédox (NDH2, ZWF1,
ALD4, ALD6, GDH1, GND1, NPY1 et KGD1) ce qui semble indiquer que la levure
doit réguler sa balance rédox pour pouvoir continuer à produire de l’éthanol
notamment après l’arrêt de la croissance (cf. fig. 4).
Un autre groupe de gènes caractérise la phase de découplage après l’arrêt de la
croissance et regroupe les gènes liés au stress osmotique (HOR7), au stress oxydatif
(GRX1, GPX1) et au stress hypoxique (ROX1, CYC7) ce qui semble indiquer que la
levure réagit à la présence d’oxygène et d’éthanol (une concentration en éthanol de
125 g/L représente 2700 mOsm/L) (cf. fig. 4).
r-RNA Processing - 5 genes
Cytoplasmic Ribosomal proteins - 60 genes
Mitochondrial Ribosomal proteins - 3 genes
Aminoacyl t-RNA Synthase - 3 genes
r-RNA Processing - 5 genes
Cytoplasmic Ribosomal proteins - 60 genes
Mitochondrial Ribosomal proteins - 3 genes
Aminoacyl t-RNA Synthase - 3 genes


Figure 4: profil d’expression de gènes impliqués dans le stress osmotique et oxydatif, la réponse
hypoxique et la régulation de la balance rédox.

La figure 5 présente le profil de sur-expression des gènes impliqués dans le
métabolisme des lipides (notamment les polyphosphoinositides) et le métabolisme lié
à la paroi, On note cependant la sous-expression importante (5 à 10 fois) de gènes
codant l’enzyme d’initiation de la synthèse des acides gras (MCT1) et à un niveau
moindre (3 fois) la synthèse des acides gras à longues chaînes (TSC13). Ces résultats
semblent indiquer un rôle de ces molécules dans la tolérance à l’éthanol.



Figure 5 : profil d’expression de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides et de la paroi
Hypoxic response - 4 genes
DNA Damage - 2 genes
Redox metabolism - 4 genes
Oxydative damage (ROS) - 7 genes
Redox metabolism - 4 genes
Hypoxic response - 4 genes
DNA Damage - 2 genes
Redox metabolism - 4 genes
Oxydative damage (ROS) - 7 genes
Redox metabolism - 4 genes
Fatty acid and Sterol metabolism - 3 genes
Polyphosphoinositides - 4 genes
Cell wall genes - 4 genes
Lipid metabolism - 9 genes
Bile transport
Fatty acid and Sterol metabolism - 3 genes
Polyphosphoinositides - 4 genes
Cell wall genes - 4 genes
Lipid metabolism - 9 genes
Fatty acid and Sterol metabolism - 3 genes
Polyphosphoinositides - 4 genes
Cell wall genes - 4 genes
Lipid metabolism - 9 genes
Bile transport

Plus intriguant est l’augmentation de gènes codant des transporteurs de différents ions
(cuivre, fer, phosphate et sulfate ; cf. figure 6) et dans une moindre mesure le transport
des hexoses, suggérant que la cellule est face à une difficulté d’homéostasie et donc
réagit en activant les transports des ions, considérant que ceux-ci ne fonctionnent pas
bien, C’est sans doute un phénomène lié aussi à la modification de la fluidité
membranaire.
Figure 6 : profil d’expression de gènes impliqués le transport

Concernant le glycogène, on observe la sur-expression de trois gènes régulant
positivement l’activité de la glycogène synthase GSY2 (GAC1, PIG2 et GIP2). Cette
sur-expression corrèle avec l’accumulation de glycogène pour atteindre un maximum
de 2,5% du poids sec des cellules au bout de 30 heures de fermentation.

Lors d’un choc éthanol, Alexandre H.(2001) ont comparé le profil d’expression avant
(absence d’éthanol) et après l’ajout de 7% (v/v) d’éthanol dans le milieu.

Dans la
figure 7 sont représentés en rouge les gènes sur-exprimés. Peu sont trouvés en
commun entre un choc éthanol et l’adaptation à l’éthanol. En revanche les différences
sont nombreuses notamment le métabolisme rédox, des lipides, certains transporteurs
et des gènes de réponse au stress oxydatif ou hypoxique. En vert, sont représentés les
gènes sous-exprimés dans les deux conditions On retrouvent en commun beaucoup de
gènes liés à la transcription et la traduction, du fait du ralentissement de la croissance
observé dans les deux conditions opératoires.
Copper transport and resistance - 5 genes
Iron transport - 2 genes
Lipid related transport - 2 genes
Phosphate and Sulfate transport - 2 genes
Hexose transport - 8 genes
RNA transport (nucleopore) - 3 genes
Copper transport and resistance - 5 genes
Iron transport - 2 genes
Lipid related transport - 2 genes
Phosphate and Sulfate transport - 2 genes
Hexose transport - 8 genes
RNA transport (nucleopore) - 3 genes


Figure 7 : comparaison des résultats d’expression entre « adaptation » à l’éthanol et « choc » à l’éthanol. (*Les
chiffres représentent le nombre de gènes dans chaque catégorie : sur ou sous-exprimés, choc, adaptation ou
commun aux 2)

En conclusion, et pour consolider ces données génomiques, nous avons entrepris une
analyse de la composition lipidique des membranes. Y-a-t'il une diminution de la
teneur en lipides. Si oui est-elle due à une amplification du phénomène de dégradation
ou un ralentissement de la synthèse ? La dégradation est-elle plutôt passive (la
molécule d’éthanol entraînerait des changements physico-chimique) ou active
(remaniement des lipides via une réponse biologique) pour la cellule? Quels sont les
remaniements pariétaux mis en place par la levure lors de l’adaptation à
l’accumulation sa propre production d’éthanol?
Nous allons également quantifier les métabolites intra-cellulaires mesurés au cours du
procédé de fermentation et vérifier que l’activité des enzymes, correspondant aux
gènes dont l’expression a été sérieusement modifiée, est aussi affectée. Enfin, les
analyses d’image qui nous donnent déjà des indications sur la viabilité des cellules,
seront complétées par une analyse de la taille et de la morphologie et par un comptage
des cicatrices de bourgeonnement pour mieux caractériser nos observations de sur-
expression de gènes de stress osmotique et la croissance.
Enfin, à partir du nombre important de données acquises sur différentes conditions de
fermentation, il sera nécessaire de réconcilier
les 3 niveaux d’observation
(macroscopique, microscopique et moléculaire) afin de mieux comprendre le
phénomène d’adaptation de la levure aux fortes concentrations en éthanol et de mettre
le doigt sur les cibles les plus pertinentes pour améliorer la tolérance. Ce travail
demandera le développement d’outils mathématiques originaux qui pourront avoir des
répercussions importantes sur les stratégies visant à optimiser le procédé fermentaire.

Références
Alfenore S., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2002) : 67-72.
Alfenore S., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63 (5) (2003):537-42.
Alexandre H., et al. FEBS Letters 498 (2001):98-103
Le berre V., et al., Nucleic Acids Res.;31 (16) (2003):e88.

HOG pathway
NDH2, HOR7
CUP1
MCT1
sporulation
Lipides:
YBT1, SNF2
Transport
Synthèse
protéique
Synthèse
protéique
Synthèse
protéique
193*
422*
207*
428*
Choc
Adaptation
38*
68*
(S288C) (CBS8066)
stress
ROS genes et
hypoxic genes:
Redox
metabolism
HOG pathway
NDH2, HOR7
CUP1
MCT1
sporulation
Lipides:
YBT1, SNF2
Transport
Synthèse
protéique
Synthèse
protéique
Synthèse
protéique
193*
422*
207*
428*
Choc
Adaptation
38*
68*
(S288C) (CBS8066)
stress
ROS genes et
hypoxic genes:
Redox
metabolism

B.2. Identification des gènes et réseaux de gènes et de leur rôle dans l’adaptation des levures à
l’éthanol (Contribution S. Dequin, V. Ansanay Laboratoire de Microbiologie et Technologie des
Fermentations, ENSAM-INRA-UMI Montpellier)


Ce projet, qui vise à identifier des gènes et réseaux de gènes et à préciser leur rôle dans
l’adaptation des levures à l’éthanol, a été mené par deux types d’approches. Une première
approche a consisté à rechercher et à caractériser des mutants d’insertion affectés dans la
résistance à l’éthanol, l’autre approche a consisté à étudier la réponse génique à l’éthanol par
analyse transcriptomique.
1 - Identification de gènes impliqués dans la résistance de la levure à l’éthanol par
l’étude de mutants d’insertion


Des banques d’insertion aléatoire de transposons ont été utilisées pour transformer une souche
de levure (RZ-53-6). Après transformation, 45 000 clones ont été repiqués sur milieu
minimum contenant 5% d’éthanol. 185 clones présentant une sensibilité accrue à l’éthanol ont
été isolés. Le phénotype de ces mutants a été précisé dans une gamme de concentration en
éthanol variant de 0 à 10 % (v/v). A l’issue de ce test, 22 clones présentant un phénotype
marqué ont été retenus. A ce jour, 1 gène a pu être identifier : le gène RPH1et l’identification
des 21 autres gènes est en cours.
Le gène RPH1 code pour un régulateur du gène PHR1, une apoenzyme intervenant dans la
réparation des dommages à l’ADN. La disruption de ce gène dans la souche de laboratoire
RZ-53-6 ainsi que dans la souche V5, possédant des capacités fermentaires proche d’une
souche œnologique, a été réalisée. L’impact de ces disruptions dans diverses conditions de
stress et plus particulièrement en présence d’éthanol est en cours d’évaluation.

2 - Etude de la réponse génique des levures à l’éthanol par analyse du transcriptome


L’objectif de cette approche est d’identifier des gènes qui sont spécifiquement exprimés en
présence de fortes concentrations d’éthanol et donc susceptibles d’être impliqués dans
l’adaptation de la levure en conditions de fermentation alcoolique. Nous avons dans un
premier temps mis au point un modèle expérimental mimant les conditions œnologiques où la
teneur en éthanol est seule variable. Ce modèle consiste à ajouter de manière progressive 5%
(v/v) d’éthanol sur une durée totale de 15h, à une population de levures (dérivant d’une
souche de levure œnologique) en phase stationnaire de croissance, alors que la production
d’éthanol est faible (2%v/v). A la fin de l’ajout la concentration en éthanol est d’environ 8%,
au lieu de 3% dans la fermentation témoin. Les profils d’expression de ces deux populations
de levures ont alors été comparés par hybridation d’ADNc marqués à des microarrays d’ADN
(lame de verre) où sont déposés l’ensemble des 6000 gènes de la levure.

L’analyse des résultats montre que dans nos conditions bien que les cellules aient déjà subit
un stress lors de l’entrée en phase stationnaire, l’éthanol conduit à une régulation d’un grand
nombre de gènes, en effet 11% du génome de la levure est différentiellement exprimé. Parmi
les gènes induits et réprimés d’un facteur deux, on trouve un grand nombre de gènes de
fonctions inconnus (figure 1).

Figure 1 : Distribution des gènes régulés en réponse à un ajout progressif d’éthanol en
fonction des catégories fonctionnelles les plus représentées. A : gènes réprimés ; B : gènes
induits.
Un certain nombre de ces gènes interviennent dans des mécanismes connus pour être
impliqués dans la réponse au stress éthanol, ce qui valide notre approche. En effet 12% des
gènes induits codent pour des protéines de stress thermique (figure 1). Egalement, le gène
HSP30 codant pour un régulateur de l’ATPase membranaire et les gènes codant pour des
protéines impliquées dans la synthèse du tréhalose sont induits.
Ainsi, dans les conditions œnologiques, l’éthanol constitue un important facteur de stress
conduisant à une réponse de type stress général.
Le premier aspect important de cette réponse est la régulation fine du pool énergétique (figure
1), au travers de la régulation de gènes codant pour des enzymes glycolytiques, pour des
protéines impliquées dans le métabolisme du tréhalose et du glycogène, ainsi que dans la
régulation de l’activité de l’ATPase membranaire (figure 2).

Figure 2 : Effet de l’éthanol
sur la régulation des gènes
impliqués dans les voies de
la glycolyse, du tréhalose,
du glycogène et dans la
régulation de l’ATPase
membranaire







A
B
NTH2 (2.1)
ATH1 (2)
Glycerol

Fru-1-6-P
DHAP

GAP
DHA

G3P

2PG
PYRUVATE
ACETALDEHYDE
ETHANOL

ACETATE
DAK1
YPR1-GCY1
GPD1, 2
FBA1
TDH1 (1.9),
TDH2, TDH3
PGK1 (2.5)
Phosphoenol pyruvate
PDC1,5,6
3PG
GPM1(2), GPM2 (2.4)
ENO1, ENO2
Fru-6-P
PFK26 (2.4),
PFK1, PFK2
FBP1 (2)
1-3PG
TPI1
PYK1
ADH1,2,3,4
GUT2 (2.2)
GPP1,
HOR2
GUT1
PGI1
+
HSP30
HSP30 (16)

-
ATP ADP
H
+
PTK2
PTK2
+
ATPas
GLK1 (2),
HXK2
TSL1 (2)
GLUCOSE

Glc-6-
Glc-1-
TREHALOSE

HXK1(2.9)
TPS1 (2.1)

UGP1 (2.1)
GLYCOGEN
GSY1(2.5)
GLG1,
GLG2
GLUCOSE

UDP-Glc

PGM1, PGM2

Gènes induits
(facteur d’induction)
Métabolisme
carboné
13%
Gènes de
stress
12%
Energie
8%
Devenir des
protéines
3%
Fonction
inconnue
22%
Autres
42%
Transcription
12%
Métabolisme
nucléotidique
5%
Autres
31%
Fonction inconnue
21%
Systèmes de
transport
5%
Métabolisme des
lipides
4%
Croissance
cellulaire
5%
Synthèse protéique
17%

Nous avons pu mettre en évidence également la surexpression des gènes codant pour des
protéines de stress thermique. La co-induction de ces gènes de stress ainsi que les gènes
impliqués dans la synthèse et la dégradation du tréhalose étaye l’hypothèse selon laquelle un
système de protection, similaire à celui décrit pour le choc thermique, serait mis en place par
la cellule en réponse à un stress éthanol.
Enfin, les gènes impliqués dans diverses activités bio-synthétiques, telles que la synthèse des
protéines, la croissance cellulaire et la transcription sont réprimés. La répression des gènes
impliqués dans des fonctions associées à la croissance et à la viabilité des cellules est tout à
fait en accord avec les phénomènes d’inhibition de croissance et de viabilité cellulaire induits
par l’éthanol et décrit dans la littérature. Toutefois, un résultat surprenant de la réponse à
l’éthanol dans nos conditions est la répression des gènes impliqués dans le métabolisme et le
transport des stérols. En effet, bien que cette répression semble contradictoire avec un
possible rôle des stérols dans la tolérance à l’éthanol, il est en accord avec les résultats
d’analyse du profil d’expression d’une souche de levure industrielle au cours de la
fermentation œnologique. En effet, cette étude montre que l’expression des gènes impliqués
dans la synthèse de l’ergostérol décroît dès l’entrée en phase stationnaire lorsque la
concentration en éthanol est supérieure à 3% (v/v). On peut donc supposer que dans les
conditions de fermentation l’éthanol est un facteur important du contrôle de l’expression des
gènes de la voie de biosynthèse des stérols en réprimant les gènes impliqués.

Figure 3 : Effet de l’éthanol sur la régulation des gènes de la voie de biosynthèse de
l’ergostérol. Les facteurs d’induction pour chaque gène sont indiqués entre parenthèse.
Acetyl-CoA
IPP
MVA
HMGCoA
GPP
FPP
Squalène
Lanostéro
Zymostérol
Ergostérol
Esters de stétol
ERG10 (-
3.8)
HMG1 (-3.5)
HMG2
ERG12 (-2.6)
ERG8,
MVD1 (-2.7)
IDI1 (-3.1)
ERG20
ERG20
Prénylation
Ubiquinone
Dolichol
ERG
ERG1 (-3)
ERG7 (-3)
ERG11,ERG24
ERG25,
ERG26 (-2.6)
ERG28 (-2.1)
ERG27 (-2.1)
ERG6 (-9)
,
ERG2 (-2.9)
ERG3,
ERG5 (-6.4),
ERG4
ARE1,
ARE2 (-5.3)

B.3. Contribution des facteurs de transcription Msn2 et Msn4 au métabolisme du glucose dans
la réponse générale aux stress (Contribution M. Jacquet, Institut de Génétique et
Microbiologie UMR C8621)


Le laboratoire de Michel Jacquet (implanté à l’Institut de Génétique et Microbiologie UMR
C8621, s’intéresse depuis de nombreuses années à la voie de signalisation Ras/AMPc/PKA et
à son rôle physiologique dans la cellule S. cerevisiae. La protéine kinase AMPc dépendante
(PKA) a un effet négatif important sur la résistance des cellules à de nombreux stress. Une
partie de cet effet est relayée par les facteurs de transcriptions Msn2p et Msn4p. Ces facteurs
de transcription sont activés par un grand nombre de variations environnementales (stress et
carences nutritionnelles) en particulier les stress ethanol et thermiques. La phosphorylation de
ces facteurs par la PKA exerce un contrôle négatif en les maintenant dans le cytoplasme
(Görner et al, 1998) et en empêchant des phosphorylations par d’autres kinases (Garreau et al,
2000). L’activation de ces facteurs de transcription participe à la résistance des cellules aux
stress (Martinez-Pastor et al,1996) et conduit dans certaines conditions à un arrêt du cycle
cellulaire en G1, ce qui permet de postuler que Msn2p et Msn4p sont des éléments essentiels
d’un “ checkpoint ” activé par les stress (Smith et al, 1998)).
La caractérisation des gènes dont l’expression dépend de Msn2p et Msn4p (régulon Msn2/4)
en réponse à de stress variés, par une approche protéomique et par une approche
transcriptome (Boy Marcotte et al 1998 & 1999, Gasch et al., 2000 ; Causton et al., 2001), a
permis de dresser l’ inventaire complet de ce régulon. Celui-ci se caractérise par le grand
nombre de gènes codant pour des enzymes du métabolisme du glucose. Pour un grand nombre
de ces enzymes, il existe des isoenzymes et l’induction par Msn2/4 conduit à un changement
d’expression d’isozymes. L'activation de Msn2p et Msn4p par les stress doit donc conduire à
un changement de l'équipement enzymatique responsable du métabolisme glucose.
Nous nous intéressons aux conséquences de l’activation de Msn2p et Msn4p sur le
métabolisme de la cellule, en particulier le métabolisme du glucose, Nous voulons, dans un
premier temps, décrire ces changements puis comprendre en quoi ces modifications
participent à l’adaptation des cellules aux stress. Nous comptons plus précisément examiner
l’effet de la surexpression de la protéine Msn2p et de la délétion des gènes MSN2 et MSN4
sur les flux des métabolites dérivés du glucose et sur les bilans énergétiques.
Un premier travail a consisté à exprimer Msn2 à partir d’un promoteur fort (ADH1) et d’un
plasmide multicopie dans deux souches de référence : d’une part la souche W303msn2msn4
qui est délétée pour le gènes MSN2 et MSN4 et d’autre part la souche 654, souche de
référence du Laboratoire de Biotechnologies & Bioprocédés utilisée pour les études du
métabolisme du glucose en fermenteur. Nous avons constaté que la surexpression du gène
MSN2 ne permet pas une expression significative du gène cible HSP12 en absence de stress.
La synthèse de tréhalose est dépendante de l’induction par Msn2/4 des gènes de biosynthèse
du tréhalose. Nous avons montré par une approche de spectroscopie C13-RMN que la
surexpression de MSN2 ne permet pas la synthèse de tréhalose en absence de choc thermique.
Ces résultats son cohérents avec les données du transcriptome dans les conditions de
surexpression de MSN2 et en absence de stress (Gash et al 2000). En effet, ils montrent que
seuls 94 gènes sont induits parmi les 300 gènes normalement induits par Msn2 dans différents
conditions de stress et le facteur d’induction et faible par rapport à celui observé dans les
conditions de stress. Ces résultats sont aussi en accord avec des données récentes de notre
laboratoire qui montrent que Msn2 doit être activé à plusieurs niveaux (localisation nucléaire,
activité transactivatrice). Il faut donc une version de Msn2 active de façon constitutive pour
exprimer le régulon Msn2 en absence de stress. Le travail est poursuivi dans ce sens.
Ce travail est effectué en collaboration avec le laboratoire de J.M. François à l’INSA de
Toulouse. Les résultats de cette étude devraient nous permettre d’évaluer si les facteurs de

transcription Msn2p et Msn4p influent le métabolisme du glucose et sont des cibles
pertinentes à manipuler pour la construction de souches performantes dans la production de
bioéthanol carburant.
Références
Boy-Marcotte, E., Lagniel, G., Perrot, M., Bussereau, F., Boudoscq, A., Jacquet, M., and Labarre, J. (1999). The
heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2/4 and Hsf1p regulons. Mol.
Microbiol. 33, 274-283.
Boy-Marcotte, E., Perrot, M., Bussereau, F., Boucherie, H., and Jacquet, M. (1998). Msn2p and Msn4p control a
large number of genes induced at the diauxic transition which are repressed by cyclic AMP in Saccharomyces
cerevisiae. J. Bacteriol. 180, 1044-1052.
Causton, H. C., Ren, B., Koh, S. S., Harbison, C. T., Kanin, E., Jennings, E. G., Lee, T. I., True, H. L., Lander,
E. S. and Young, R. A. (2001). Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes.
Mol. Biol. Cell. 12, 323-327
Görner, W., Durchschlag, E., Martinez-Pastor, M. T., Estruch, F., Ammerer, G., Hamilton, B., Ruis, H., and
Schüller, C. (1998). Nuclear localization of the C2H2 zinc finger protein Msn2p is regulated by stress and
protein kinase A activity. Genes Dev. 12, 586-597.
Martinez-Pastor, M. T., Marchler, G., Schüller, C., Marchler-Bauer, A., Ruis, H., and Estruch, F. (1996). The
Saccharomyces cerevisiae Zinc finger proteins Msn2p and Msn4p are required for transcriptional induction
through the stress-response element (STRE). EMBO J. 15, 2227-2235.
Smith, A., Ward, M. P. and Garret, S. (1998). Yeast PKA represses Msn2/4p –dependent gene expression to
regulate growth, stress response and glycogene accumulation. The Embo J. 17, 3556-3564


Volet 3 : « Mise en œuvre de levures par des procédés performants pour la production
d’éthanol bio-carburant et bio-procédés propres de mise en œuvre » Coordinateur du
projet : C. Jouve, UMR 5504 Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés Toulouse
Objectif:
Ces travaux ont pour objectif l’optimisation des performances des procédés de production
microbienne d’éthanol par
1.la maîtrise du comportement microbien en condition de production intensive d’éthanol
2. la définition et la mise en œuvre d’un bioréacteur pertinent et innovant pour
l’obtention de hautes performances en termes de productivité, titre et rendement,
Dans une première partie, ce document présente donc les travaux ayant permis d’établir
l’influence de paramètres opératoires (température, aération, apport vitaminique) sur le
comportement de la levure en conditions de production intensive d’éthanol. Nous décrivons
ensuite le pilote dédié à la production d’éthanol dont le principe est déduit des études
préliminaires et des travaux antérieurs réalisés au Laboratoire. Les essais expérimentaux sont
ensuite présentés et discutés.
I.Etudes préliminaires :

A l’issue de cultures en mode fed-batch sur milieu synthétique en conditions de température,
pH(4), aération et agitation parfaitement contrôlés, nous avons étudié l’influence sur le
comportement dynamique de la levure Saccharomyces cerevisiae (CBS 8066) de trois
stratégies d’apport vitaminique, de cinq niveaux de température de fermentation et de deux
conditions d’aération. Il s’avère que :
1.l’apport séquencé de vitamines est un facteur déterminant de la tolérance de la
levure aux très fortes concentration en éthanol [1]; la quantité de vitamines et le mode
d’apport des vitamines influencent l’inhibition de l’éthanol sur la croissance et la
production d’éthanol : les concentrations en éthanol « critiques » pour lesquelles
interviennent l’arrêt de la croissance, l’arrêt de la production et le découplage
croissance/production sont décalées vers des valeurs croissantes lorsque la quantité de
vitamines augmente et s’opère de façon séquencée.
2.les températures optimales, vis à vis du taux de croissance et de la vitesse
spécifique de production d’éthanol, sont respectivement 30°C et 33°C, la viabilité
cellulaire étant fortement affectée par une élévation de la température aux très fortes
concentrations en éthanol [2];
3.l’aération permet d’augmenter la tolérance de la levure (viabilité, inhibition de la
croissance et titre final en éthanol), diminuer la production de glycérol et accroître
le rendement sucre-éthanol par comparaison avec des conditions de micro-aération
[3].

Ces travaux nous ont permis de définir les conditions optimisant les performances de
production d’éthanol de la levure Saccharomyces cerevisiae en mode fed-batch. Un titre en
éthanol de 147 g/L (19°G.L.) en 45 heures [1] a été obtenu avec ajout séquencé de
vitamines, à 30°C, pH4, en l’absence de limitation en oxygène. Les productivités moyenne et
instantanée maximale sont respectivement 3,3 g.L
-1
.h
-1
et 9.5 g.L
-1
.h
-1
, positionnant ces
résultats parmi les plus hautes performances mentionnées dans la littérature.


II.Le bioréacteur biétagé avec recyclage cellulaire :

II .1. Principe de fonctionnement
Le bioréacteur biétagé avec recyclage cellulaire a été déduit des résultats établis au
Laboratoire de Biotechnologie et Bioprocédés afin de permettre l’intensification de
production microbienne selon des critères de maximisation de titre, productivité, de
rendement et de minimisation du substrat résiduel.. Il s’agit d’obtenir de hautes
concentrations en microorganismes actifs et viables dans des conditions de concentrations en
produit très élevées.
Le schéma de fonctionnement du bioréacteur biétagé avec recyclage cellulaire est
présenté ci-dessous :
Alimentation
Q1
Purge 1
Q6
Q2/1
Q3/2
Q1/2
air
air
gaz
gaz
Q2/3
Q3
Q4
Réacteur 1 Réacteur 2
Ultra-
Filtration
Perméat
Purge 2
Q7
Xt1, X1
S1, P1
G1
Xt2, X2
S2, P2
G2
Alimentation
Q1
Purge 1
Q6
Q2/1
Q3/2
Q1/2
air
air
gaz
gaz
Q2/3
Q3
Q4
Réacteur 1 Réacteur 2
Ultra-
Filtration
Perméat
Purge 2
Q7
Alimentation
Q1
Purge 1
Q6
Q2/1
Q3/2
Q1/2
air
air
gaz
gaz
Q2/3
Q3
Q4
Réacteur 1 Réacteur 2
Ultra-
Filtration
Perméat
Purge 2
Q7
Xt1, X1
S1, P1
G1
Xt2, X2
S2, P2
G2
Figure 1 : Principe de fonctionnement du Bioréacteur Biétagé avec recyclage
cellulaire

Le procédé comprend deux étages : un premier étage aéré dans lequel se déroulera la
réaction de croissance. Il permettra l’obtention de microorganismes dans un état
physiologique favorable à la production d’éthanol qui s’effectuera dans le second réacteur. La
concentration en éthanol doit être maintenue en dessous de 78g/l pour permettre aux
microorganismes d’assimiler les facteurs de croissance apportés et particulièrement la Biotine
(Winter, 1988). Ce fermenteur alimente un deuxième étage microaéré. Il est couplé à un
système de filtration tangentielle qui permet d’atteindre des densités cellulaires élevées jusqu
à 330 g/l de masse sèche dans le cas de Saccharomyces cerevisiae (Lafforgue,1988). Une
purge au niveau du second étage permet de contrôler la concentration cellulaire. La gestion de
la viabilité et de l’activité des micro-organismes est réalisée par recirculation du volume

réactionnel de R2 vers R1 où des conditions optimales de flux nutritionnel sont mises en
œuvre, déduites des résultats expérimentaux obtenus dans la partie I..
II.2.Description du pilote :
Nous décrivons en annexe 1 le pilote de génération 5 par rapport à la configuration
initiale. Des évolutions notables du pilote ont été déduites des premiers essais expérimentaux
qui ont permis l’identification de limites technologiques, physico-chimiques et biologiques
(pertes de viabilité par effet de variations locales de pression, dégagement de CO2 en quantité
importante et donc évolution d’un milieu di-phasique (gaz-liquide) vers un milieu tri-
phasique (gaz-solide-liquide) en condition de concentrations élevées en biomassse,
hétérogénéités de mélange, de température…)
Commande et acquisition :
A été réalisé avec la collaboration de l’équipe d’Automatique des Bioréacteurs du
Laboratoire, l’environnement informatique qui permet :
- l’acquisition en temps réel de 25 paramètres (tous les débits de pompes, des mesures des
débitmètres massiques liquide et gaz, des capteurs de température, pH, agitation et oxygène
dissous, des pressions amont et aval des modules d’ultrafiltration, des compositions des gaz
de sortie des fermenteurs )
- le système de commande des pompes d’alimentation en eau et de circulation de R1 vers R2
par des détecteurs de niveau dans les deux fermenteurs respectivement R1 et R2,
- la gestion informatisée des systèmes de sécurité
- l’étalonnage des capteurs et des pompes,
- le traitement de certaines données en ligne (estimation du taux de croissance, du substrat
résiduel, de la vitesse spécifique de production de CO2, de la vitesse spécifique de la
consommation d’oxygène…)

Une photographie de l’installation complète est présenté en annexe 2.

II.3. Modélisation :
A partir des études préliminaires (culture en mode fed-batch), nous avons établi deux modèles
cinétiques en conditions d’aération et de micro-aération qui correspondent respectivement aux
modes de fonctionnement des deux étages du bioréacteur.
Avec des écarts théorie-expérience inférieures à 9%, ce modèle prend en compte :
- de processus biologiques limitant de glucose et inhibiteurs de l’éthanol et de la
biomasse,
- la viabilité des micro-organismes,
- l’effet des hautes concentrations de biomasse sur le volume total,
- la répartition intracellulaire et extracellulaire de l’éthanol
- la production de co-métabolites
Les valeurs des paramètres biologiques identifiés corroborant ceux mentionnés dans la
littérature, le modèle s’exprime de la façon suivante :
µ=µ
max
*(S/(K
sx
+S))*(1-(P/P
mx
))
n
*(1-(X
t
/X
m
))
Ȟ
p
= Ȟ
pmax
*(S/(K
sp
+S))*(1-(P/P
mp
))
m

Ȟ
g
= Įµ+İ
q
s
= µ/Y
s,x

p
/Y
s,p
+ Ȟ
g
/Y
s,g
+ main

0 si P<120g/l
K si P>120g/l
Kd=
0 si P<120g/l
K si P>120g/l
0 si P<P
md
K si P>P
md
Kd=
0 si P<120g/l
K si P>120g/l
0 si P<120g/l
K si P>120g/l
Kd=
0 si P<120g/l
K si P>120g/l
0 si P<P
md
K si P>P
md
Kd=
0 si P<120g/l
K si P>120g/l
0 si P<P
md
K si P>P
md
Kd=

A l’issue de ces travaux, nous avons établi l’ensemble des équations de bilan matière
permettant, avec les équations cinétiques, de simuler le fonctionnement du bioréacteur en
régime permanent. En respectant les contraintes physiques et biologiques de fonctionnement
que nous avons listées, les résultats numériques ont permis de dégager l’influence des
paramètres opératoires sur les performances du bioréacteur en fonction des objectifs définis :
obtention de hautes concentrations en biomasse et/ou optimisation de la production d’éthanol
en termes de productivité, titre et rendements. Nous avons défini des stratégies de conduite et
des points de fonctionnement en régime continu permanent.

II. 4. Essais expérimentaux :

Les premiers travaux nous ont permis de
- caractériser hydrauliquement le bio-réacteur,
- déterminer les flux transmembranaires,
- tester les capteurs,
- valider le système d’acquisition, le traitement des données et les sécurités
- tester la robustesse des régulations
- améliorer la technologie par l’implantation notamment d’un cyclone afin de favoriser
la désorption du CO
2
produit en grande quantité en cours de culture, phénomène qui
pertube le fonctionnement des pompes et des capteurs.
Les cultures se déroulent ne deux ou plusieurs phases : une phase de démarrage en mode
batch puis un ou plusieurs phases successives en mode continu.

i.La phase de démarrage :
Deux stratégies de démarrage du bioréacteur, en mode batch, ont été testées :
1.le pilote est considéré comme un seul réacteur homogène : R1+R2
2.les deux étages sont séparés afin d’étudier, par comparaison entre les deux étages,
l’influence des différents organes du second étage (pompes, membranes
d’ultrafiltration, cyclone…) sur les cinétiques biologiques.

Nous avons montré que la pompe de circulation dans le module d’ultrafiltration n’induit pas
de perturbation des dynamiques biologiques ; les réacteurs, contenant du milieu minéral
complet (fed_batch optimisé) initialement à 100 g/L de glucose, sont donc ensemencés
simultanément par le même levain réparti au prorata de leurs volumes respectifs. Le réacteur
R2 fonctionne avec la boucle d’ultrafiltration (débit tangentiel dans la membrane égal à 2500
L/h).
La phase batch dure entre 10h et 12h, à 30°C, pH régulé à 4.0 par ajout de NH
3
(14% (v/v))
avec ajout séquencé de vitamines à chaque doublement de population. Un exemple de
résultats expérimentaux est présenté ci-dessous, inclus dans les résultats de la phase continue.
En fin de phase de démarrage (phase batch), les concentrations en sucre dans les deux
réacteurs sont quasi-nulles, la concentration en biomasse avoisinent 15 g/L et la concentration
en éthanol est de l’ordre de 40 à 50 g/L.
ii.La phase continue
Les paramètres du continu sont prédits par le modèle en fonction de différentes stratégies de
conduite. Dans un premier temps, nous souhaitons acquérir la maîtrise du comportement du
micro-organisme en condition de haute concentration en l’absence d’inhibition par l’éthanol

puis étudier les performances du bioréacteur en termes de production d’éthanol (productivité
et titre). Les expériences sont donc menées de la façon suivante :
a.obtention d’une concentration en biomasse à 50 g/L dans R2, et un titre en
éthanol maximum de 40 g/L
b.obtention d’une concentration en biomasse à 100 g/L dans R2, et un titre en
éthanol maximum de 40 g/L
c.d’une concentration en biomasse à 150 g/L dans R2, et un titre en éthanol
maximum de 40 g/L
d.essais de production d’éthanol.

Par souci de clarté et compte-tenu de la lourdeur expérimentale, seuls quelques
résultats bruts (cinétiques de croissance production et consommation du substrat) seront
présentés. Lors des expérimentations, les analyses sont réalisées à plusieurs niveaux
d’observation, en régime permanent et /ou en régime transitoire :
macroscopique : cinétiques des composés majoritaires (substrat, biomasse,
éthanol), des métabolites secondaires (acide acétique, glycérol…), caractérisation
physico-chimique du milieu, rhéologie, mesure de densité ;
microscopique : mesure de la viabilité cellulaire, analyses morphologiques par
analyse d’images, quantification des métabolites intracellulaires ;
moléculaire : prélèvement d’échantillon pour des puces à ADN.

Stratégie : Biomasse = 50 g/L – Ethanol < 40g/L

La figure suivante présente pour deux expériences distinctes (A et B) les résultats
obtenus en terme de biomasse, viabilité, consommation du substrat (Figure 2) et production
d’éthanol (Figure 3)
Figure 2 : Evolution de la croissance dans les réacteurs R1 et R2 au cours de la culture de la
souche S.c. CBS 8066
en BRM pour 2 expérimentations différentes réalisées selon les mêmes
stratégies : phase batch (12h) en réacteurs séparés puis passage en continu (apports
contrôlés de sucre, milieu salin, vitamines)
0
50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30 35 40 45
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temps (h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
X_R1 (A)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Viabilité(A)
Viabilité(A)
Viabilité(B)
Viabilité(B)
Phase Batch
Continu 1
X_R1 (B)
X_R2 (A)
X_R2 (B)
Biomasse (g/L)


ETOH_R1
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R1
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R1
ETOH_R1
ETOH_R1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R2
ETOH_R1
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R1
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R2
ETOH_R1
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
ETOH_R1
ETOH_R1
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R1
ETOH_R1
ETOH_R1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
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0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R2
Glucose_R2
Temps (h)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
20
40
60
80
100
120
Gluc_R1
Gluc_R2
EtOH_R1
EtOH_R2
Continu 1
ETOH_R2
ETOH_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2
Glucose_R1
Glucose_R2

Durant la phase batch, une parfaite reproductibilité est observée sur les phases de
croissance et sur l’évolution de la viabilité cellulaire. Durant la phase continue, la
concentration en biomasse se stabilise au bout de 25h (12h de phase continue) à une
concentration de 20 g/L environ dans le réacteur R1. Dans le même temps, la concentration en
biomasse augmente significativement dans R2, pour se stabiliser entre 50 et 55 g/L au bout de
30h de culture. Une légère diminution est observée sur la concentration en biomasse dans le
réacteur R2 lors de la première expérience: cette diminution est due à un phénomène de
dilution, provoqué par un ajout massif de milieu d’alimentation, après un soutirage important
du volume de R2 récupéré par la régulation de niveau.
Globalement, une bonne reproductibilité est observée sur la phase continue sur les
variables macroscopiques et microscopiques ; la viabilité cellulaire, varie peu d’une
expérience à l’autre avec un niveau tout à fait acceptable entre 95% et 80%.
La figure suivante (Figure3) présente les résultats relatifs aux évolutions du sucre
résiduel et de l’éthanol produit dans les 2 réacteurs durant la phase continue .

Figure3 : Evolution du sucre résiduel et de la concentration en éthanol dans les réacteurs R1
et R2 au cours de la culture continue de la souche S.c. CBS 8066
en BRM (apports contrôlés
de sucre, milieu salin, vitamines, Température 30°C, pH régulé à 4.0).

La figure montre une stabilisation très rapide des paramètres dans le réacteur R1. En
effet, dès le début de la phase continue, les concentrations en éthanol et en glucose se
stabilisent à des concentrations respectivement de 15 g/L et 30 g/L dans R1 et R2. Il faut
attendre environ 15h pour observer une stabilisation dans le deuxième réacteur, tout d’abord
sur le sucre (dont la concentration résiduelle est de l’ordre de 5 g/L) puis plus tardivement sur
l’éthanol qui se stabilisent après 40h environ de phase continue.
Les objectifs initialement fixés par la simulation sont parfaitement respectés puisque la
concentration en biomasse obtenue dans le réacteur R2 est de 55 g/l avec une viabilité de
l’ordre de 85%, et la concentration en éthanol est de 30 g/L (< 40g/L).
Ces résultats sont très encourageants et la durée expérimentale du régime transitoire est
relativement « faible » si on la compare aux prévisions de simulation par le modèle qui prédit
un régime permanent après 200h de culture.
Ethanol (g/L)
S résiduel
(g
/L
)

De façon similaire (résultats non présentés), nous disposons aujourd’hui d’expériences
en concentrations croissantes en biomasse jusqu’à des valeurs de 150 g/l sans inhibition par
l’éthanol. Afin de tester les potentialités du système, nous avons choisi, après cette phase
continue, de déclencher une stratégie de production d’éthanol, qui consiste en l’augmentation
significative de la coulée de substrat sans effet inhibiteur, c’est à dire sans accumulation
d’une concentration en sucre supérieure à 150 g/L.
Production d’éthanol
Les résultats expérimentaux sont présentés sur la figure 4 pour les réacteurs R1 et R2
respectivement
0
20
40
60
80
100
120
140
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
temps (h)
Concentration (g/l)
DO
Glucose
Ethanol

réacteur1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
Temps (h)
Concentration (g/l)
DO_R2
Glucose_R2
Ethanol_R2

réacteur 2
Figure 4 : Evolution du sucre résiduel et de la concentration en éthanol et en biomasse dans
les réacteurs R1 et R2 au cours de la culture continue de la souche S.c. CBS 8066
en BRM
(apports contrôlés de sucre, milieu salin, vitamines, Température 30°C, pH régulé à 4.0). Ph

Les concentrations mesurées en éthanol sont respectivement de 20 g/L et de 60 g/L en régime
continu. La productivité en éthanol dans le réacteur de production s’élève à 25 g/L/h . La
concentration en substrat résiduel est nulle dans le second réacteur.
Phase Continue


Conclusion

L’ensemble des travaux réalisés nous ont permis d’établir les points forts suivants :
1.Des performances, situées au meilleur niveau international, ont été obtenues à partir
de la connaissance de l’influence des paramètres opératoires sur le comportement de
la levure en conditions de production d’éthanol : un titre en éthanol de 147 g/L
(19°G.L.) en 45 heures [1] a été obtenu avec ajout séquencé de vitamines, à 30°C,
pH4, en l’absence de limitation en oxygène.
2.Nous disposons aujourd’hui d’un pilote dédié à la production intensive d’éthanol,
fiable, robuste, parfaitement instrumenté ; la configuration actuelle est issue d’un
travail important d’évolutions technologiques issue des essais préliminaires visant à
réduire les hétérogénéités de température, de concentration, les contraintes de
cisaillement, les variations locales importantes de pression… De génération 5, ce
pilote est particulièrement bien adapté à la mise en œuvre de hautes densités
cellulaires et la production d’éthanol.
3.Les milieux nutritionnels ont été élaborés pour éviter toute limitation ou inhibition
biologique en mode continu.
4. Les protocoles des analyses du comportement de la levure aux échelles
macroscopiques (cinétiques de croissance, production, rendement, rhéologie…),
microscopiques (morphologie par analyse d’image, eau intracellulaire, composition
lipidique, protéinique…… ) et moléculaires (métabolites intracellulaires) sont définis.
5.Nous disposons également à l’heure actuelle de protocoles robustes et fiables
concernant le démarrage de l’installation. Cette phase est parfaitement maîtrisée en
terme de conduite de réacteur et nous permet de poursuivre en phase continue avec
des points initiaux parfaitement reproductibles (15 g/L de biomasse viable, sucre
résiduel quasi-nul, 35 g/L d’éthanol environ).
6.Les essais en continu montrent la robustesse et la fiabilité du pilote. Nous avons
réalisé à ce jour
des expériences permettant de stabiliser des concentrations en biomasse croissantes de 20 g/l,
50 g/l, 100 g/l, 150 g/l sans accumulation d’éthanol au delà de 40 g/L ;
des expériences permettant de stabiliser une concentration en éthanol de 60 g/l, une
productivité de 25 g/L/h et une concentration en substrat résiduel nulle.
Les durées d’obtention des régimes permanent sont relativement rapides (40h).
Un modèle non structuré du fonctionnement du bioréacteur en régime permanent permet de
prédire de façon fiable les performances du procédé en fonction des paramètres opératoires
(écarts théorie/expérience inférieurs à 8%).
Les expériences à venir vont s’attacher à stabiliser le système pour différentes stratégies à
savoir :
- obtention d’une concentration en biomasse de 200, 250 et 300 g/l dans R2, un
titre en éthanol de 40 g/L afin d’identifier les limites biologiques et physico-
chimiques de hautes densités cellulaires
- obtention d’une concentration en éthanol de 120 g/l en continu ou d’une
productivité de 40 g/L/h avec une concentration en substrat résiduelle nulle.

Des efforts doivent être réalisés dans la caractérisation et la maîtrise des
écoulements et transferts en milieux tri-phasiques gaz-liquide-solide : en présence
de hautes concentrations en biomasse et en éthanol, les quantités de CO2 formées

(environ 1 g de CO2 formé par gramme d’éthanol produit) sont très importantes ;
le milieu peut être initialement considéré comme di-phasique (gaz/liquide) ; il
évolue vers un milieu tri-phasique gaz/solide/liquide qui accroit
considérablement la complexité des phénomènes biologiques et physico-
chimiques mis en jeu dans le bioréacteur.

Ce programme est également soutenu par l’ADEME/AGRICE.
Publications
[1] S. Alfenore, C. Molina-Jouve, S.E. Guillouet, J.-L. Uribelarrea, G.Goma, L. Benbadis
(2002) : Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a
vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol. Biotechnol., 60 : 67-72.
[2]A.S. Aldiguier, S. Alfenore, X. Cameleyre, G. Goma, JL Uribelarrea , S.E. Guillouet, C.
Molina-Jouve (2004) : Synergistic temperature and ethanol effect on Saccharomyces
cerevisiae dynamic behaviour in ethanol bio-fuel production. Sous presse dans Bioprocess
and Biosystems engineering
[3] S. Alfenore,X. Cameleyre, L. Benbadis C. Bideaux, J.-L. Uribelarrea, G. Goma, C.
Molina-Jouve, S.E. Guillouet (2004). Aeration strategy: a need for Very High Ethanol
Performance in Saccharomyces cerevisiae fed batch process.
Applied Microbiology and Biotechnolog .65: 537-542

Communications orales dans des congrès nationaux ou internationaux
M. Cot
, S. Alfenore, X. Cameleyre, V. le Berre, S. Sokol, S. Jasson, J-L. Uribelarrea

,
C. Molina-Jouve, G. Goma

, J. François, S. Guillouet, L. Benbadis

(2004) : A genomic
analysis of the dynamic adaptation of the yeast Saccharomyces cerevisiae to high
concentration of produced ethanol. 2
nd
International Meeting on Physiology of Yeast and
Filamentous Fungi (PYFF2), 24-28 mars 2004, Anglet, (France)
S. Alfenore
, A.S. Aldiguier, L. Benbadis, X. Cameleyre, S.E. Guillouet, C. Jouve, J.L.
Uribelarrea, G. Goma (2003) : Ethanol bio-carburant : vers de hautes performances de
productivité et de titre. 9
ème
Congrès SFGP, 9-11Septembre 2003, St-Nazaire (France)
M. Cot, L. Benbadis,S. Alfenore, X. Cameleyre, V. Le Berre, S. Sokol, S. Jasson, C.Jouve,
J.-L. Uribelarrea, S.E. Guillouet, G.Goma, J. François
(2003) : A genomic analysis of the
dynamic adaptation of yeast to high ethanol production. 1
st
FEMS Congress of European
Microbiologists, 29 Juin- 03 Juillet 2003, Ljubljana, (Slovénie).

PRI Biocarburant éthanol
Colloque du Programme Energie CNRS, Perpignan, 11-13 décembre 2002
C. Molina-Jouve
, P. Blanc, A. Alfenore, X. Cameleyre, Se Guillouet, F. Charbit, JP Belaich,
C. Innocent, G. Goma
PRI Biocarburant éthanol
Colloque Action Concertée Energie CNRS, Poitiers, 24-26 Novembre 2003
C. Molina-Jouve
, P. Blanc, A. Alfenore, X. Cameleyre, Se Guillouet, F. Charbit,JP Belaich,
C. Innocent, G. Goma
Biomasse pour l’Energie et Biocarburant
Débat National sur l’Energie, Cité des Sciences, 5 Avril 2003, Paris
G. Goma
et C. Molina-Jouve

Communication(s) internationale(s) avec actes complets et comité de sélection sur le texte
entier
S. Alfenore, A.S. Aldiguier, L. Benbadis, X. Cameleyre, S.E. Guillouet, C. Jouve, J.L.
Uribelarrea, G. Goma (2003) : Ethanol bio-carburant : vers de hautes performances de
productivité et de titre. « Récents progrès en Génie des Procédés » (ss presse)



GAZ
M
M
M
M
M
M
pH
pH
Alimentatio
ns
GAZ
M
M
M
M
M
M
pH
pH
Alimentatio
ns
Suivi consommation
NH3
GAZ
M
M
M
M
M
M
pH
pH
Alimentatio
ns
GAZ
M
M
M
M
M
M
pH
pH
Alimentatio
ns
Suivi consommation
NH3
(1a)
(2)
(
3
)
(1b)
Q
21
Q
12
Annexe 1




L’installation est composée de l’association de deux fermenteurs B. Braun Biotech
International CMF100 chemap de volume total 2 litres et de deux modules d’ultrafiltration.
Chaque fermenteur est muni d’une unité de contrôle CBC5 et de sondes de mesure de la
température, du pH, de l’agitation (pales rushton) et de l’oxygène dissout. Ils sont munis
d’une platine supérieure en acier inoxydable qui comporte différents orifices permettant
l’introduction de bases et d’anti-mousse par l’intermédiaire d’un septum, et une sortie des
gaz. La température au sein des deux réacteurs est régulée grâce à une circulation d’eau dans
une double enveloppe issue d’un bain avec résistance chauffante. Deux clapets tarés
permettent de limiter la sur-pression dans le bioréacteur à 0.2 bar. La surface de chaque
membrane d’ultrafiltration, CERAM Inside Tami de type marguerite, à 8 canaux de diamètre
hydraulique 6 mm, de longueur 120 cm, de diamètre extérieur 25 mm, de seuil de coupure
150 kD, est de 0.20m
2
. Les modules de filtration peuvent fonctionner de manière alternative
ou simultanée par l’intermédiaire de deux jeux de quatre vannes à membrane. Une vanne à
membrane, située en sortie des modules de filtration, permet de fixer la pression aval, la
mesure de cette dernière et de la pression amont étant réalisée par des capteurs Rosemount.
La circulation des fluides (alimentation du réacteur R1 en solution de glucose concentré à
raison de 700 g/l, en vitamines et en milieu, circulation de R1 vers R2 et de R2 vers R1,
soutirage du perméat) est réalisée par des pompes périlstatiques Masterflex. La circulation du
milieu réactionnel dans la boucle de concentration est assurée par une pompe à rotor excentré
type Moineau (Compact M6000C4) de débit maximal 4.5m
3
/h. Un échangeur de chaleur
externe est fixé autour du coprs de la pompe afin d’assurer son refroidissement par circulation
de polyéthylèneglycol Deux débitmètres massiques à effet Coriolis Brooks Micromotion
permettent de déterminer le débit total de perméat et le débit dans la boucle de concentration

cellulaire. Les débits d’air dans chacun des fermenteurs sont commandés par deux
débitmètres massiques gaz Instrutec. Un échangeur multi-tubulaire une seule passe, dont le
débit d’eau dans la double enveloppe est régulé par l’intermédiaire d’une électro-vanne sur la
mesure de température de sortie de l’échangeur permet de compléter le système de régulation
de température des fermenteurs. Les gaz de fermentation issus des deux fermenteurs sont
envoyés vers une Chromatographie Phase Gaz, via un condenseur et un déshumidificateur.
Un cyclone en inox est inséré dans le circuit de la boucle d’ultrafiltration en sortie du module
membranaire. Deux balances Sartorius (précision 0.01 g) permettent le suivi de la masse
d’ammoniac ajoutée dans chaque réacteur.
Annexe 2 : Photographie du pilote :


Volet 4 : « Extraction du bioéthanol » Coordinateur du projet : C. Jouve, UMR 5504
Laboratoire de Biotechnologie Bioprocédés Toulouse
A) Développement de membranes peu perméables à l’éthanol. (C. Innocent, Institut
Européen des Membranes.)

Dans le cadre de nos activité de recherche à l’Institut Européen des Membranes et en
particulier dans le groupe « Matériaux ioniques : physico-chimie et procédés » nous nous
sommes intéressés à la modification de surface de membranes échangeuses d’ions.
Les membranes échangeuses d’ions sont largement utilisées dans les techniques séparatives
comme l’électrodialyse, la dialyse ou encore pour la production d’énergie. Elles constituent
alors les séparateurs des compartiments anodiques et cathodiques des piles. La membrane
échangeuse de cations Nafion

de Dupont a fait l’objet de très nombreuses études depuis sa
commercialisation il y a une trentaine d’années
1
. En particulier, la modification de surface de
cette membrane afin de changer ses propriétés de transport a été largement étudiée. Des
travaux antérieurs concernant la modification de surface de membrane par du polypyrrole
2

ont permis de montrer les possibilités offertes par l’ajout de ce polymère conducteur sur la
membrane
3
.
L’objectif de notre travail a été d’étendre ce concept de modification par polymérisation d’un
réseau polymère interpénétré dans le matériau fluoré de la Nafion

en étudiant sa formation
en milieu solvant. L’utilisation du solvant permet en effet une expansion du réseau fluoré et
favorise ainsi l’incorporation des monomères à l’intérieur de la matrice polymère.

1.Membranes échangeuses d’ions :

Une membrane échangeuse d’ions (MEI) est composée d’un ensemble de chaînes
macromoléculaires plus ou moins réticulées en un réseau tridimensionnel insoluble sur
lesquels sont fixés des groupes fonctionnels ionisables qui lui confèrent sa spécificité.
membrane échangeuse de cations (MEC) dans le cas de la fixation de site chargés
négativement, membrane échangeuses d’anions (MEA) pour des sites chargés positivement.
La figure 1 représente une description schématique d’une MEA.


Figure 1 : structure d’une membrane échangeuse d’nions.


[
1
] M. Doyle et al. J. Membr. Sci, 184, 257 (2001) et références citées.
[
2
] T. Sata J. Membr. Sci 66, 289 (1992)
[
3
] T. Sata et al. J. Membr. Sci 206 31 (2002)

2. Caractérisation du transport - Mesures de spectroscopie RAMAN

La perméabilité au solvant des membranes a été déterminée en utilisant une cellule dont le
schéma est réprésenté sur la figure 2. Il s’agit d’une cellule de Hittorf permettant de mesurer
le nombre de transport des membranes et adaptée pour la mesure du transport de solvant.

figure2 : cellule de Hittorf.

La quantité de solvant dans les différents compartiments a été mesurée par spectroscopie
RAMAN [
4
].
La détermination de la quantité d’alcool dans la solution est obtenue grâce à l’ajout d’un
étalon interne (acétonitrile) en quantité connue et constante (5% en volume). A partir des
spectres RAMAN (figure 3) de différentes solutions de concentration croissante en éthanol,
une courbe d’étalonnage est réalisée en effectuant le rapport des aires des pics relatifs à
l’éthanol (878 cm
-1
) et à l’acétonitrile (925 cm
-1
) (figure 4).
L’analyse du spectre RAMAN (calcul du rapport des pics) permet grâce à la courbe
d’étalonnage de déterminer le pourcentage volumique d’alcool dans la solution et ensuite de
calculer le flux (en mol.min
-1
.cm
-2
).

0
1000
2000
3000
4000
5000
700 800 900 1000 1100 1200
longueur d'onde cm
-1
intensité (a.u.)
E 0,5%
E 1%
E 4%
E 10%

Figure 3 : Spectres RAMAN de solutions aqueuses d’éthanol de pourcentage volumique variable en présence de
5 % d’acétonitrile. Temps d’aquisition : 120 s.



4
[
4
] E.M. Valejo, P. Huguet, C. Innocent, F. Persin, J.L. Bribes, G. Pourcelly, J. Phys. Chem.
B, 103, (1999), 11366-11371
H
2
SO
4
(0,1 N) + 50
% EtOH
H
2
SO
4
(0,1 N)
V=20 mL V=200 mL

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5
teneur en pourcentage d'éthanol
Rapport des aires (EtOH / CN)

Figure 4. Courbe d’étalonnage d’éthanol en pourcentage volumique en présence de 5 % d’acétonitrile.

3.Modification de membrane :

Le principe de modification de surface de membranes consiste à utiliser une membrane qui
possède de bonnes performances de transport et une bonne stabilité mécanique et d’améliorer
ses propriétés grâce à l’ajout d’éléments chimiques. Plusieurs techniques sont possibles ;
l’adsorption de composés en surface, méthode simple mais peu stable en raison de la
désorption plus ou moins rapide observée au cours du temps lors du fonctionnement du
matériau. Un autre technique consiste à greffer chimiquement des composés en surface de la
membrane. Toutefois ce greffage nécessite souvent des réactifs puissants qui peuvent
modifier le matériau membranaire. C’est pourquoi nous nous sommes interessés à la
modification par imprégnation d’un polymère généré in situ : le polypyrrole. Le principe
consiste à faire diffuser le pyrrole dans la membrane en présence de solvant puis à l’oxyder
chimiquement afin de le polymériser dans la membrane. Pour cela nous avons utilisé une
membrane dotée de bonne propriétés de gonflement en milieu solvant : la membrane Nafion

.
Trois types d’agent oxydant ont été étudiés : FeCl
3
, H
2
O
2
et K
2
S
2
O
8
.

Figure 5 : photographies de la membrane vierge et modifiée.

La figure 5 représente le changement morphologique observé lors de la modification de la
membrane. En effet, celle-ci est totalement transparente dans son état initiale. Après
modification elle devient noir, couleur liée à la présence de polypyrrole dans la membrane.
Nafion Nafion-polypyrrole

Les résultats de perméabilité des membranes à l’éthanol sont reportés dans les figures 6 et 7.
Flux de EtOH (50% v) en mode diffusionnel et électro-osmotique
0.0E+00
1.0E-05
2.0E-05
3.0E-05
4.0E-05
5.0E-05
6.0E-05
7.0E-05
Nafion 117 M1 M3
flux (mol.min-1.cm-2)
diffusion
électro-osmose

Figure 6 : Flux d’éthanol à travers la membrane vierge (Nafion 117) et les membranes modifiées (M1et M3) ,
solution d’éthanol / eau : 50% en volume.

Flux de EtH (99,7% v) en mode diffusionnelle et
électro-osmotique
0.0E+00
2.0E-05
4.0E-05
6.0E-05
8.0E-05
1.0E-04
1.2E-04
1.4E-04
Nafion M1 M3
flux (mol.min-1.cm-2)
diffusion
électro-osmose

Figure 7 : Flux d’éthanol à travers la membrane vierge (Nafion 117) et les membranes modifiée (M1et M3),
solution d’ethanol / eau : 99.7% en volume.

La perméabilité à l’éthanol est diminuée par la présence de polypyrrole dans la membrane.
Cette diminution est observée lors de la diffusion de solvant, mais aussi par électro-osmose
c’est à dire lors de l’application d’un champ électrique. Le polymère interpénétré dans la
matrice membranaire contribue donc à limiter le transport de solvant. Ceci est sans doute dû
aux propriétés hydrophobes du polypyrrole, qui modifie la perméabilité de la membrane aux
solvants. Une étude complète (non présentée dans ce rapport) a permis de montrer que la
modification de la membrane ne changeait pas les propriétés d’échange d’ions du matériau
(sélectivité vis-à-vis de différents cations). Le polymère polypyrrole semble donc se structurer
dans les zones hydrophobe de la matrice sans interférer avec les zones hydrophiles,
responsable de la conductivité ionique.
Les membranes ainsi obtenues ont été aussi appliquées et caractérisées sur bancs de pile à
combustible (collaboration avec Laboratoire des Agrégats Moléculaires et des matériaux
inorganiques (LAMMI de Montpellier). En effet, la membrane modifiée par le polypyrrole
possèdent une perméabilité au méthanol plus faible que la membrane vierge ce qui s’avère
particulièrement intéressant pour le fonctionnement de la pile à combustible à méthanol
directe.

Les perspectives de ce travail consisteront à étudier le comportement de ces membranes
modifiées en pervaporation pour le transport sélectifs des solvants. En particulier la
comparaison des différents résultats de transport en fonction du procédé mis en œuvre
pourrait permettre de mieux comprendre le mode d’influence du polypyrrole sur le transport
de solvant.
B) Production d’éthanol à partir d’un fermenteur biologique (faisabilité et coût) (F.
Charbit, Laboratoire de Procédés Propres et Environnement, Aix-en-Provence).
Séparation d'éthanol à partir de l’effluent d'un fermenteur biologique par
pervaporation

Les procédés membranaires peuvent opérer des séparations très délicates de suspensions de
solides extrêmement divisés (micro-organismes) ou de solutions vraies. Ils paraissaient donc
très bien adaptés à l’accompagnement du procédé de fabrication du biocarburant éthanol. La
conduite du procédé de production d’éthanol permet d’utiliser la pervaporation, qui semble la
mieux adaptée puisqu’elle permet de séparer les mélanges de liquides grâce à des membranes
hydrophiles ou hydrophobes suivant la nature du composé à séparer, pour traiter la solution
produite afin de séparer et concentrer l’éthanol.
Ce procédé permet de récupérer et de concentrer l'éthanol produit avec ou sans élimination de
la biomasse quelles que soient les concentrations amont et aval (contrainte sur la qualité du
produit final et visé). En effet, l’éthanol est contenu dans une solution complexe et se trouve
en présence d’eau, de sucres, d’acides, de glycérol, de sels et éventuellement de levures selon
les étapes précédemment définies. L’étude bibliographique a montré que la séparation d’un
mélange eau éthanol a été abondamment étudiée, mais les co-produits présents dans l’effluent
du bioréacteur modifient considérablement le problème posé à cause notamment des effets de
couplage non quantifiables ex nihilo. Il faut donc nécessairement étudier les mélanges
réellement produits par fermentation. De nombreux paramètres entrent en jeu lors de la
séparation de l’éthanol : membrane, température, pression et composition.
Les objectifs de notre participation à cette étude on été modifiés au cours de l’avancement des
travaux. En effet, nous intervenons à la toute fin du procédé de production et de purification
de l’éthanol. Ainsi, les spécifications de la solution sortie du bioréacteur ont varié passant par
exemple de 10 à 30 % d’éthanol. De la même manière, le cahier des charges concernant
l’éthanol à produire peut varier considérablement suivant l’utilisation envisagée. On a, dans
les derniers mois, choisi de rechercher les meilleures conditions pour une large gamme de
puretés d’éthanol adaptable aux besoins.
Nous avons construit une unité qui fonctionne suivant le schéma classique (cf. Figure) et qui a
permis de tester des membranes organiques de compositions différentes mais aussi des
membranes sur support poreux récentes. En effet, les membranes de géométrie tubulaire
présentent plusieurs avantages : la turbulence y est parfaitement contrôlée, un prétraitement
fin n’est pas nécessaire et donc on a éventuellement la possibilité de récupérer l'alcool à partir
d'un mélange contenant la biomasse.

pompe à vide
piège froid
alimentation
rétentat
module membranaire
pompe de
recirculation
vanne
régulation
de pression
perméat



Figure : Schéma du pilote de pervaporation

Dans un premier temps nous avons calibré notre étude par la concentration d’éthanol à partir
d’un mélange simple eau – éthanol. Nous avons testé sur ce mélange plusieurs membranes
planes et tubulaire. Il s’est avéré que l’utilisation d’une membrane tubulaire sur support
poreux permettait d’avoir des flux de perméat du même ordre de grandeur que ceux produits
par des membranes planes. En revanche, la sélectivité de la membrane tubulaire est deux fois
plus grande que celle d’une membrane plane, contrairement aux tendances généralement
observées selon lesquelles les flux et les sélectivités varient en sens contraire. D’autre part
nous avons montré que la géométrie de la membrane et du module membranaire ont une
importance capitale lorsqu’une couche liquide se forme en aval de la membrane et limite
fortement le transfert. C’est le cas notamment pour des composés lourds comme le glycérol
ou lorsque la pression est élevée pour tous les composés.
Nous avons donc poursuivi nos recherches avec une membrane tubulaire (PDMS sur support
en aluminate) et des solutions de complexité croissante (eau éthanol glycérol, eau éthanol
acide acétique, eau éthanol glycérol acide acétique, …). Sur la solution binaire nous avons
estimé le nombre d’étages de pervaporation nécessaire pour obtenir un éthanol proche de 99
% de pureté à partir d’une solution à environ 10 % d’éthanol. Des essais de séparation de
mélanges ternaires, quaternaires et réels ont été ensuite réalisés.
Il s’agissait d'étudier l'effet de toutes les variables opératoires en termes de sélectivité et de
flux de perméat, de modéliser la séparation pour prédire le comportement de la membrane en
fonction de la solution à traiter puis d’extrapoler sa surface pour obtenir la production
nominale du cahier des charges.
Une augmentation de température a tendance à augmenter le flux de perméat obtenu.
Cependant nous avons choisi de travailler à une température peu élevée afin de limiter le coût
énergétique de la séparation. De la même manière, une augmentation de la pression en aval de
la membrane entraîne une diminution du flux de perméat mais également une diminution du
coût énergétique.
Les composés les plus abondants dans le perméat réel sorti du fermenteur, susceptibles de
modifier sensiblement le comportement de la membrane vis à vis de la séparation d’éthanol
sont le glycérol et l’acide acétique. En terme de flux de perméat, nos résultats sur des
solutions synthétiques montrent que la présence des tiers corps ne modifie que très peu les
résultats satisfaisants obtenus sur le mélange binaire. Il en est de même pour la concentration
d’éthanol à partir de la solution quaternaire. En ce qui concerne le traitement de la solution
réellement issue du fermenteur, nous avons travaillé à une température de 30 °C et à une
pression en aval de la membrane de 12 mbar. Nous obtenons quasiment les mêmes résultats
que pour le mélange quaternaire synthétique à savoir un flux d’environ 100 g.h
-1
.m
-2
.

Les résultats précis en terme de sélectivité pour la solution réelle qui nous permettront
d’évaluer la production réelle en éthanol sont encore en cours de validation. En effet, compte
tenu de la complexité de la solution amont à traiter, nous ne faisons pas nous-mêmes les
analyses, ce qui ralentit les programmes expérimentaux. De plus un point important encore lié
à la complexité de la solution amont, est la longévité des performances des membranes qu’il
faut valider sur un temps suffisant.
Quoi qu’il en soit, la comparaison avec un procédé plus conventionnel comme la distillation
ne pourra se faire qu’en définissant les objectifs de production du biocarburant avec les
critères définis par des motoristes qui doivent préciser la gamme de concentration optimale.
Enfin, notre étude comportera une modélisation de la séparation pour faciliter la conduite de
procédés et s’adapter à toutes les variations comme celle de la composition de la solution
produite par le bioréacteur ou de la pureté du perméat visé.


Rapport 2004 du PRI "Biocarburant-éthanol"


Optimisation de la croissance et de la capacité fermentaire chez une levure
Saccharomyces cerevisiae résistante à l’éthanol. (M. Rigoulet, Laboratoire d’étude du
métabolisme énergétique cellulaire, UMR 5095, Bordeaux).

1) Optimisation de la croissance aérobie des levures.


La croissance aérobie des levures dépend de leur capacité à coupler les réactions de
transduction d'énergie à la formation de biomasse. Deux systèmes de transduction d'énergie
sont présents dans les organismes non photosynthétiques : la glycolyse et les oxydations
phosphorylantes. Chez la levure, qui est une cellule aérobie facultative, la contribution de
chacune des deux voies dépend essentiellement de la nature de la source carbonée et de sa
disponibilité. Cependant, la gestion de la balance rédox et l'état énergétique
cellulaireconstituent des contraintes cinétiques incontournables. L'amélioration de la
croissance aérobie d'une levure pose donc le problème de la levée partielle de ces contraintes.
La capacité respiratoire des levures lors de situations physiologiques variées semblent
strictement corrélée à la quantité de mitochondries par cellule. Il est maintenant prouvé que le
contenu des cellules en mitochondries est un élément clé de l’homéostasie cellulaire,
permettant de répondre à de larges variations en besoins énergétiques ( Dejean et al, 2000,
Biochim. Biophys. Acta, 1457, 45-56). Sa régulation nécessite l’expression coordonnée de
plusieurs centaines de gènes nucléaires et mitochondriaux. Nous avons entrepris de
développer, en collaboration avec le groupe de Claude Jacq (ENS, Paris), une approche
génomique globale afin de caractériser les différents groupes de gènes impliqués dans les
réponses transcriptionnelles lors de l’induction de la biogenèse mitochondriale.
L’identification des voies de signalisation gouvernant cette biogenèse est, à l'heure actuelle,
une des préoccupations majeures de notre groupe. Différentes études conduites aussi bien
chez la levure que chez des eucaryotes supérieurs suggèrent que la voie Ras/AMPc/protéine
kinase AMPc dépendante (PKA) est impliquée dans la modification quantitative de
l'équipement enzymatique mitochondrial lors de divers processus d'adaptation. Nous avons
ainsi pu montrer par l'utilisation de différents mutants qu'une activation permanente de cette
voie induit une augmentation de la quantité de cytochromes de la chaîne respiratoire, alors
qu'une diminution de l'activité de cette voie a pour effet de réduire la quantité de
cytochromes. Ces changements sont bien corrélés aux variations de la capacité maximale de
la chaîne respiratoire et à l'activité de la citrate synthase, enzyme matricielle souvent
considérée comme un marqueur mitochondrial pertinent ( Dejean et al, 2002, BBRC, 293,
1383-1388 ). Nos travaux les plus récents ont permis de caractériser une spécificité de
signalisation au niveau des kinases: seulela sous-unité catalytique Tpk3p des PKA semble
directement impliquée dans la régulation de l'équipement enzymatique mitochondrial. Il est à
noter que si l'accroissement du contenu mitochondrial des cellules peut, dans certaines
conditions, conduire à une augmentation de la vitesse de multiplication des levures, ceci
s'accompagne toujours d'une diminution du rendement de croissance (biomasse formée/
substrat consommé). L'activation de la voie Ras/AMPc/protéine kinase AMPc dépendante
permet aussi une augmentation de la fermentation alcoolique lorsque la source carbonée est le
glucose (Dejean et al, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1554, 159-169). Ainsi, l'activation
permanente de cette voie de signalisation semble une réponse adaptée à la résolution de
certains de nos objectifs: amélioration de la vitesse de multiplication des cellules (même si
cela se fait au dépend du rendement de croissance), augmentation et orientation favorable du
flux fermentaire (plus d'éthanol et moins de glycérol produits). Cependant, la voie

Ras/AMPc/protéine kinase est impliquée dans de très nombreux processus vitaux de la levure
et en particulier dans les mécanismes de réponse aux stress. Or, le but ici poursuivi est
d'optimiser la croissance et la fermentation chez une levure résistante à l'éthanol et il est à
craindre que l'activation permanente de la voie Ras entraîne une perte des capacités
d'adaptation de la levure.
Un travail effectué en collaboration avec le groupe de Luc Pénicaud (Toulouse) sur
des cellules de mammifères, nous avait permis de montrer qu'un léger découplage des
oxydations phosphorylantes induisait une augmentation de la prolifération cellulaire,
conséquence d'une limitation de production des espèces activées de l'oxygène (ROS)
(Carrière et al, 2003, FEBS, 550, 163-167). Un découplage modéré, contrôlé dans le temps et
réversible des oxydations phosphorylantes pouvait être obtenu chez la levure. En effet, grâce
à Jean-Paul di Rago (IBGC, Bordeaux), nous disposons d’une souche dans laquelle
l’expression de la sous-unité  de la F1-F0-ATPsynthase mitochondriale peut être contrôlée
par simple addition de doxycycline dans le milieu de culture (utilisation d’un promoteur
sensible à la doxycycline). Une déplétion partielle en sous-unité  conduit à la formation d’un
certain nombre d’ATPsynthases dépourvues de cette sous-unité et ainsi rendues perméables
aux protons. Dans ces conditions de faible découplage des oxydations phosphorylantes, nous
avons pu observer une forte augmentation de la vitesse de la respiration maximale associée à
un doublement du contenu en cytochromes et à un accroissement de la masse mitochondriale
(dosages enzymatiques confirmés par des analyses d'images de microscopie électronique).
Ceci permet une nette amélioration de la vitesse de multiplication des levures en phase
exponentielle de croissance sur substrat respiratoire. Nous disposons donc d'un système qui
permet de bien maîtriser la cinétique d’induction de la biogenèse mitochondriale et de définir
les conditions optimale de croissance. Une étude systématique des conséquences sur la
croissance et sur l’équipement mitochondrial de différents degrés de découplage nous a
conduit à préciser la concentration en doxycycline et la durée du traitement. L'étude de la
capacité fermentaire et de son évolution lors du traitement à la doxycycline a fourni des
résultats difficiles à interpréter: la transcription de tous les gènes codant pour des enzymes de
la glycolyse est fortement activée alors que la production d'éthanol semble peu affectée. La
mesure de l'activité des différentes enzymes reste à faire. Il conviendrait maintenant de
reprendre ce travail en utilisant les souches particulièrement résistantes à l’éthanol qui sont en
voie de sélection dans le groupe du Professeur J.M. François. Enfin, les résultats de l’analyse
globale de l’expression du génome, lors de l’induction de la biogenèse mitochondriale, s'ils
n'ont pas permis de caractériser les facteurs de transcription responsables de la réponse
initiale, ont décrit un processus d'activation concernant l'ensemble des systèmes producteurs
d'énergie et de réponse aux stress.

2) L’état énergétique cellulaire et l’amélioration de la production d’éthanol


Afin d’optimiser l’efficacité fermentaire d’une levure, il convient tout d’abord de faire
une analyse des flux métaboliques, de l’état énergétique et de la balance rédox, de décrire les
mécanismes de régulation gouvernant la relation production d’éthanol / production de
biomasse et aussi de caractériser l’effet inhibiteur de la fermentation alcoolique par l’éthanol.
Un des sous-produits majeurs de la fermentation est le glycérol. La balance entre production
de glycérol et d’éthanol lors de la fermentation dépend de plusieurs facteurs dont l’un des
principaux est l’état rédox des cellules. Plus le pool de NAD
+
sera réduit, plus le flux de
formation du glycérol aura tendance à augmenter. On peut essayer de modifier cet état et, en
particulier, de générer des potentiels plus oxydés soit en agissant sur l’équipement
enzymatique des différentes voies, soit en tentant d’imposer un état rédox favorable à la
fermentation alcoolique au détriment de la voie glycérol. Nous avons montré que le

fonctionnement de la NADH déshydrogènase externe (située sur la face externe de la
membrane interne mitochondriale et donc réoxydant le NADH cytosolique) inhibe la
réoxydation du glycérol-3-P par la chaîne respiratoire et, donc constitue un frein à l'activité de
la navette glycérol-3-P (Pahlman et al, 2002, J Biol. Chem., 277, 27991-27995). L'une des
deux isoformes de la NADH déshydrogénase est responsable de cette inhibition et l'on peut
imaginer que la délétion du gène qui la code pourrait permettre une moindre production de
glycérol sans altérer les activités de réoxydation du NADH cytosolique. Une autre possibilité
est à envisager: l’introduction dans les cellules d’un système actif de réoxydation du NADH
indépendant de la fermentation elle-même.
Si l’impact de la manipulation de l’état rédox est théoriquement déterminant on peut
aussi supposer qu’une augmentation de la consommation d’ATP (création de cycles futiles
par exemple) ou une introduction d’un léger découplage favoriserait aussi le drainage du flux
métabolique vers l’éthanol. Le modèle de découplage induit par la doxycycline et décrit ci-
dessus à confirmé cette hypothèse. Enfin, on peut aussi agir sur le flux de la glycolyse elle-
même en modifiant l’équipement enzymatique et en diminuant ainsi les contraintes cinétiques
de ce réseau métabolique. Ces pistes, théoriquement justifiées, devaient être
systématiquement explorées. Cependant, malgré nos efforts répétés (demandes de BDI, de
financement pour post-doc), nous n'avons pas pu obtenir qu'une personne puisse à plein temps
s'investir dans cette étude lourde, qui demande beaucoup de travail et de temps. Ceci est
d'autant plus regrettable qu'une efficacité optimale nécessiterait de mener une approche pas à
pas : en effet, il pourrait apparaître des incompatibilités sérieuses dues aux différents objectifs
que nous nous proposons (amélioration de la vitesse de multiplication des cellules, résistance
à de fortes teneurs en éthanol, augmentation et orientation du flux fermentaire). Dans ce cas,
seule la connaissance de l'ensemble des paramètres pourrait conduire à l'obtention du meilleur
compromis possible.