Publikációs lista letöltése

chatteryellvilleBiotechnology

Feb 20, 2013 (4 years and 5 months ago)

349 views

A MYCOSTOP PROGRAM K
UTATÁSI EREDMÉNYEIBŐ
L
MEGJELENT
VAGY ELFOGADOTT


PUBLIKÁCIÓK (CIKKEK,

ELŐADÁSOK) LISTÁJA


1. Lektorált közlemények

hazai és nemzetközi folyóiratban megjelent közlemény
ek


1.1.

Comparison of the structure and the stability of single enzyme nanoparticles.
Hungarian
journal of Industrial Chemistry
, 2009, 37 (2), 123
-
130.
I. Hegedüs
1
, E. Nagy
1


1
Research Institute of Chemical and Process Engineering, FIT, University of Pannonia,
Egy
etem u.10., H
-
8200 Veszprém, HUNGARY, Tel.: +3688
-
624
-
040, Fax: +3688
-
624
-
038


E
-
mail: nagye@mik.vein.hu


Abstract

Single enzyme complex nanoparticles were synthesized following the method of
Kim et al [1]. The enzyme complex used was cellulosome that is a

large spatial association of
enzymes. Single enzyme nanoparticle of celluclast BG cellulase enzyme complex (SEN
-
CK)
can degrade as great substrates as natural cellulose. It was proved that the stability of SEN
-
CK enzyme complex is significantly better tha
n that of native enzyme complex (enzyme
without pretreatment). Significant portion of the activity of SEN
-
CK is remaining at 80

o
C for
1 hour time.



1.2.
Adaptation of bacterial biotests for monitoring mycotoxins
, 2010,
in
Environmental
Toxicology III, edited by V. Popov,
Wessex Institute of Technology, UK and
C.A
.
Brebbia
Wessex Institute of Technology, UK,
Published by
WIT Press
Ashurst Lodge, Ashurst,
Southampton, SO40 7AA, UK pp 143
-
154.

Cs. Krifaton
1
, J. Kukolya
3
, S. Sz
oboszlay
2
, M.
Cserháti
2
,

Á. Szűcs
1
& B. Kriszt
2

1
Szent István University, Regional Center of Excellence, Hungary

2
Szent István University,

Environmental Protection and Environmental Safety, Hungary

3
Agruniver Holding Ltd., Hungary

Abstract

Mycotoxins are
secondary fungal metabolites that have mutagenic, carcinogenic,

teratogenic, immunomodulant and cytotoxic effects. Besides expensive chemical

analytical
methods, biotests can be alternative screening methods for selecting

mycotoxin degrading
microbes. Our
aim was to monitor mycotoxins by bacterial

biotests. Aflatoxin
-
B1 (AFB1),
deoxynivalenol, zearalenon, T2
-
toxin and

ochratoxin were analysed by two biotests:
Aliivibrio fischeri
luminescence assay

and SOS
-
Chromotest using
Escherichia coli
. The
A.
fischeri
b
ioluminescence

assay is one of the most sensitive bacterial toxicity assays across a
wide

spectrum of toxicants; however, the effects of mycotoxins have been hardly

examined.
The inhibition effect of various mycotoxins on
A. fischeri
was

determined in the
range of 1

20 μg/ml toxin concentration. The test bacterium

proved to be the most sensitive for AFB1.
Less but pronounced inhibition of

zearalenon was also determined, while other mycotoxins
had no measurable

toxic effect on
A. fischeri
. Based on these
results we have adopted this
method

for monitoring microbial AFB1 biodegradation efficiency. The genotoxic effect

of
mycotoxins was analysed by SOS
-
Chromotest. The principle of the assay is

the SOS response
that is induced by DNA
-
damaging agents. We have e
xamined

AFB1 0,078

10 μg/ml
concentration. We found that the genotoxic effect of

AFB1 is still detectable at 0,078 μg/ml
concentration. SOS
-
Chromotest was

successfully used to select microorganisms that have the
best AFB1 degrading

potential and can degrad
e AFB1 without genotoxic by
-
products. The

applicability of SOS
-
Chromotest for screening mycotoxin degrader microbes

was confirmed
by parallel ELISA and chemical analytical tests. We have

adopted two bacterial biotests that
are suitable for monitoring mycot
oxin

concentrations based on their biological effects. On the
basis of these results a

screening method was developed for microbes with AFB1 degrading
potential.

Furthermore, these methods can be appropriate tools for elucidating mycotoxin

metabolism by hi
gh throughput screening of expression, and transposon

mutagenesis clone
libraries of the best AFB1 degrading strains.


in Environmental Toxicology III (2010), edited by V. Popov,
Wessex Institute of Technology,
UK and
C.A. Brebbia
Wessex Institute of Techn
ology, UK,
Published by
WIT Press
Ashurst
Lodge, Ashurst, Southampton, SO40 7AA, UK pp 143
-
154.


1.3.
ASPERGILLUS FLAVUS
TÖRZSEK EL
Ő
FORDULÁSA HAZAI KUKORICA
SZEMTERMÉSBEN
, 2011,

Növényvédelem,

47 (4): 125
-
133.

Dobolyi Csaba1, Sebôk Flóra1, Varga János2, Kocsubé Sándor2, Szigeti Gyöngyi2,
Baranyi Nikolett2, Szécsi Árpád3, Lustyik György4, Micsinai Adrienn5, Tóth Beáta6,
Varga Mónika6, Kriszt Balázs7
és
Kukolya József7


Abstract:
A globális klímaváltozás fokozza
a meleget kedvelô gombák elterjedését,
következésképpen az általuk

termelt mikotoxinoknak a takarmányokban, valamint az
élelmiszerekben észlelt egyre gyakoribb

megjelenését. Az aflatoxin
-
termelô penészgombák
Európában való kimutatását a mezôgazdasági

termé
kek, így a kukorica aflatoxin
-
szennyezôdése is követte. A jelenséggel az utóbbi években

Európa számos országában, így a
hazánkkal határos Szerbiában, Szlovéniában, Horvátországban,

Romániában és Ukrajnában is
szembesülnünk kellett.

Indokoltnak látszott egy

átfogó, Magyarország kukoricatermô
területeire kiterjedô, az aflatoxint

termelô penészgombák jelenlétét tisztázó, mikrobiológiai
tenyésztésen alapuló vizsgálatsorozat elvégzése.

Bár a mezôgazdasági termékek, köztük a kukorica aflatoxin szennyezettsége, mi
nt súlyos

veszély, Magyarországon jelenleg még nem fenyeget közvetlenül, a globális felmelegedés
eredményeként

azonban ezeknek a meleget kedvelô penészgombáknak a terjedése
valószínûsíthetô.

A kukoricaszem
-
minták 65,3%
-
ából kitenyészett, az
Aspergillus
nem
zetség
Flavi
szekciójába tartozó

izolátumok részleges kalmodulinszekvenciáinak analízisével
megállapítottuk, hogy valamennyiük

az
Aspergillus flavus
fajba sorolható. Steril
kukoricaszemek laboratóriumi fertôzésével

megállapítottuk, hogy izolátumaink 42%
-
a
idéz
elô az Európai Uniós határérték feletti szintû

aflatoxinszennyezôdést a szemekben. ELISA
módszerrel végzett méréseink eredményeit HPLC
-
FLD

és HPLC
-
MS módszerekkel is
alátámasztottuk. Az
Aspergillus flavus
fajnak és különösen

aflatoxintermelô törzseine
k
világszerte gyakori elôfordulása indokolttá teszi az erre irányuló hazai

vizsgálatsorozat
folytatását, kiegészítve az aflatoxintermelô képesség felmérésével is.


1.4.
Mikotoxin bontó mikrobák screenelése bakteriális biotesztekkel
.
TUDOC


Kárpát
Medencei
Doktoranduszok Nemzetközi Konferenciája, 2010. Május 27
-
28, Gödöllő,
Konferencia kötet, p 161
-
172. (ISBN: 978
-
963
-
269
-
186
-
2).

Krifaton C., Kukolya J.,
Szoboszlay S., Cserháti M., Kriszt B.




Abstract
:
A mikotoxinok gombák másodlagos anyagcseretermékei, am
elyek karcinogén,
mutagén, teratogén, immunszupresszív, illetve citotoxikus tulajdonságaik miatt súlyos
élelmiszer
-

és környezetbiztonsági problémákat okoznak. A mikotoxinok vizsgálatára
irányuló biomonotoring rendszerek, illetve a mikotoxinok detoxifikáci
ós lehetőségeinek
fejlesztése ezért egyre nagyobb hangsúlyt kap napjainkban. A mikotoxinok eliminálásának
egyik perspektivikus ágát jelentik a biodegradációs módszerek. Napjainkban már léteznek
kereskedelmi forgalomban kapható, mikroba eredetű mikotoxin bo
ntó enzimen alapuló
takarmány kiegészítő enzimek. Különböző mikotoxinok bontására képes mikroba törzsek
szkreeneléséről és izolálásáról is elérhetőek publikációk. A

biodegradációs folyamatok azonban
rejthetnek kockázatokat is: a metabolizmus során keletkez
hetnek olyan közti
-

és melléktermékek,
amelyek egyrészt önmagukban is lehetnek a kiindulási vegyületeknél toxikusabbak, másrészt azok
interakciói is nehezen felmérhető veszélyeket jelenthetnek. Az ilyen jellegű bizonytalanságok
feloldására a biológiai hatá
st mérő toxikológiai és mutagenitás tesztek lehetnek alkalmasak.
A drága
kémiai analitikai tesztek mellett a biotesztek alternatív screening lehetőséget is biztosítanak a
biodegradáció hatékonyságának indirekt mérésével, illetve azon mikrobák szelektálásáv
al,
amelyek toxikus melléktermékek nélkül képesek a mikotoxinok eliminálására.

Munkánk célkitűzése az volt, hogy a legveszélyesebb mikotoxin, az aflatoxin B1,
valamint a zearalenon, dezoxinivalenol, ochratoxin és T2
-
toxin biológiai hatásának
detektálásán a
lapuló bakteriális
-
tesztekkel segítsük a biodegradációs képességgel rendelkező
mikroorganizmusok szelektálását. Célunk azon biztonságos törzsek kiválasztása volt, amelyek
káros melléktermékek nélkül képesek a mikotoxinok lebontására. Ehhez olyan screening
rendszer kialakítására törekedtünk, ami költséghatékony módon és gyorsan ad információt a
vizsgált mikroorganizmusok biodegradációs potenciáljáról.

Kísérleteink során a különböző mikroba
-
törzsgyűjteményekből származó mikrobák
mikotoxin degradációs képesség
ének screenelését bakteriális biotesztekkel végeztük. Ezek
segítségével kiválasztottuk a legjobb bontási képességgel rendelkező törzseket, amelyek
genotoxikus melléktermékek, köztitermékek nélkül képesek az aflatoxin B1 lebontására. Az
alkalmazott bioteszt
ek között egyrészt szerepelt az SOS
-
Chromotest, amely az
Escherichia
coli

PQ37 törzset használja tesztszervezetként és alkalmas DNS károsító vegyületek
kimutatására. Ebben a rendszerben azt lehet vizsgálni egy egyszerű kolorimetriás eljárásban,
hogy az ado
tt mikroba törzs képes
-
e az aflatoxin genotoxikus melléktermékek nélküli
biodegradációjára. A kísérleti eredmények humán alkalmazhatósága miatt, a metabolikus
aktiváció hatásának modellezésére, patkánymáj kivonattal kezelt beállításokat is
alkalmaztunk. A
biotesztek eredményeit kémiai analitikai és ELISA módszerrel végzett
párhuzamos vizsgálatokkal is alátámasztottuk.

Az alkalmazott bakteriális biotesztek másik része a citotoxicitás vizsgálatára irányult,
amihez az
Aliivibrio fischeri

baktériumot használtuk

tesztszervezetként. Az
A. fischeri
lumineszcencia gátlás módszerével végzett ökotoxikológiai módszer széles körben
alkalmazott szerves szennyezők vizsgálatára, de a tesztszervezet mikotoxinokra való
érzékenysége még alig felderített. Munkánk során megvizs
gáltuk az
A. fischeri

tesztszervezet
érzékenységét 5 mikotoxinra (aflatoxin B1, zearalenon, dezoxinivalenol, ochratoxin, T2
-
toxin). Ezek alapján az
A. fischeri

lumineszcencia gátlás módszerét sikeresen adaptáltuk az
aflatoxin B1 biodegradációjára alkalmas
mikrobatörzsek screenelésére.


Kulcsszavak
: aflatoxin
-
B1, SOS Chromotest,
Aliivibrio fischeri
, screening, biodegradáció,
genotoxicitás, citotoxicitás


2. Konferenciakiadványokban megjelent összefoglalók


2.1.
Egyedi enzim nanorészecskék orvosi alkalmazásai

Nanomedical application of single
enzyme nanoparticles

Vegyészkonferencia, Marosvásárhely, Románia, 2009 nov. 12
-
15.

HEGEDÜS Imre, prof. Dr. NAGY Endre*

Research Institute of Chemical and Process Engineering, FIT, University of Pannonia
Egyetem u. 2.,H
-
82
00 Veszprém, Hungary, Tel.: +3688
-
624
-
040, Fax: +3688
-
624
-
038,

*Corresponding author; e
-
mail: nagye@mik.vein.hu; web: www.richem.hu


Abstract

Single enzyme nanoparticles means that each individual enzyme molecule were covered with
a nanometer
-
scale polymer

network in order to increase their stability, providing longer
lifetime of enzymes for biochemical processes. The polymer network has no toxicity and has
biocompatibility and we supposed, that there is an immune isolation of the enzyme molecule.
We are in
vestigating the transfer of the single enzyme nanoparticles across the blood
-
brain
barrier in mouse.


Összefoglaló

Az egyedi enzim nanoreszecskek eseteben minden egyes enzim molekulat nehany nanometer
vastag polimer haloba burkoltunk, hogy biokemiai mővele
tek soran megnovekedjen
stabilitasuk. A polimer hálo anyaga nem toxikus, sıt, biokompatibilis. Felteteleztuk, hogy a
polimer halo vedettseget jelent az immunrendszerrel szemben is az enzim molekulak szamara.
Az egyedi enzim nanoreszecskek ver
-
agygaton tort
enı atjutasat vizsgaljuk egerekben.

2.2
Hemicellulóz bontó egyedi enzim nanorészecskék előállítása

Single enzyme
nanoparticles with hemicellulolytic activity

Műszaki Kémiai Napok, 2010. április 27
-
29.Konferencia Kiadvány


Hegedűs Imre
1
, Nagy Endre
1
, Kukol
ya József
2
, Barna Teréz
3
,
Fekete Csaba Attila
3


1
Pannon Egyetem, Műszaki Informatika Kar, Műszaki Kémiai Kutató Intézet

Egyetem u. 2. P. O. Box 158, H
-
8200 Veszprém, Hungary

2
Szent István Egyetem, Mezögazdasági Biotechnológiai és Mikrobiológiai Tanszék.

P
áter K. ú. 1, H
-
.2001 Gödöllő, Hungary

3
Debreceni Egyetem, Genetikai és Alkalmazott Mikrobiológiai Tanszék

Egyetem tér 1., Debrecen, Hungary

Summary

Hemicellulose is a mixture of various polymerized monosaccharides such as glucose,
mannose, galactose,
xylose, and so on [1,2]. Like cellulases, hemicellulases also possess
multiple activities that are used to efficiently break down their substrate and can be free or in
complex with cellulosomes [3]. Thermostable enzymes can found not only in extremophyles
but also in conventional microorganisms, such us
Thermobifida

genus.
Thermobifida fusca

cellulases are a well
-
studied but hemicellulsase enzymes are not understanded well [7,8]. This
hemicellulase enzymes have a good activity at higher temperatures (70
-
80

o
C), but this
enzymes have not a good stability at that conditions.

We try to apply our technique to stabilize thermophyl enzymes from
Thermobifida fusca


-
D
mannosidase, β
-
D
-
xylosidase, endomannanase and mutant β
-
D mannosidase enzymes). For
the stabiliza
tion of the enzymes we synthesized single enzyme nanoparticles from different
hemicellulose enzymes and after it we studied the activity and the stability features of these
enzyme nano
-
biocomposites. Single enzyme nanoparticles (SENs) means that each indiv
idual
enzyme molecules are surrounded by a three dimensional polymer layer. This polymer layer
makes the enzyme more stable than that of the nature ones and this layer can not limit the
activity of the enzyme seriously (the activity of the SEN
-
enzymes are
about 45
-
70% of the
nature enzymes but the stability of the SEN
-
enzymes are about 50 to 80 times higher than the
enzymes without polymer layer

[10,

11,

13].

During the fermentation of xylose and mannose β
-
xylosidase and β
-
mannosidase enzymes
build up as
higher supramolecular structures (hyperstructures). A hyperstructure is a large,
spatial association of cellular constituents such as molecules, macromolecules, and ions that
performs a particular function because the constituents are associated with one a
nother.

The activity of SEN
-
mannosidase is 47.8% of the natural mannosidase enzyme. The activity
of SEN
-
xylosidase enzyme is 55.3% of the natural one and the activity of SEN
-
endomannanase is 63.0% of the natural endomannanase.

β
-
xylosidase enzyme has acti
vity only in a biner form but the tetramer form of β
-
xylosidase
enzymes can produce higher activity than that of the biner form of β
-
xylosidase enzymes. In
water media the well solved form of β
-
xylosidase enzymes build up a tetrameric quaterner
structure.

The size distribution of the endomannanase enzyme during the preparation is changed. The
peak of the size distribution of the natural endomannanase enzyme is about 6

nm, but the peak
of thesize distribution of the SEN
-
endomannanase is about 15

nm. SEN
-
man
nosidase and
SEN
-
xylosidase have higher peak of their size distribution (about 60

nm).

Preliminary results shows that the stability of
β
-
xylosidase enzyme in SEN form is higher
than that of the natural β
-
xylosidase enzyme. While the natural β
-
xylosidase e
nzyme lost its
activity after 50 days on +4

o
C, the SEN
-

β
-
xylosidase remains their activity after 120

days.



2.3.
Single enzyme nanoparticles using thermostable hemicellulase enzymes

Hegedűs
Imre
1
, Nagy Endre
1
, Kukolya József
2
, Barna Teréz
3
,Fekete Csaba
Attila
3
Challenges in
Physical Chemistry and Nanoscience Conference 2010 jul. 13
-
16. Budapest, Hungary

1

Research Institute of Chemical and Process Engineering, University of Pannonia, Egyetem
u. 10, H
-
8200 Veszprém, Hungary, phone: +36
-
88
-
624044, fax: +36
-
88
-
624038,
nagy@mukki.richem.hu

2

Faculty of Agriculture and Environmental Sciences, Szent István University, Páter K. u. 1.
H
-
2100, Gödöllő, Hungary, phone: +36
-
28
-
522
-
000 ext. 2100

3

Faculty of Science and Technology, Research Institute of Genetics and
Applied
Microbiology, University of Debrecen, Egyetem tér 1. H
-
4032 Debrecen, Hungary, phone:
+36
-
52
-
512
-
900 ext. 62733

Summary

Thermostable enzymes can found not only in extremophyles but also in conventional
microorganisms, such us
Thermobifida

genus.
Th
ermobifida fusca

cellulases are a well
-
studied but hemicellulsase enzymes are not understanded well [1]. This hemicellulase
enzymes have a good activity at higher temperatures (70
-
80

o
C), but this enzymes have not a
good stability at that conditions. Hemic
ellulose is a mixture of various polymerized
monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, xylose, and so on. Like cellulases,
hemicellulases also possess multiple activities that are used to efficiently break down their
substrate and can be free or

in complex with cellulosomes.

Single enzyme nanoparticles (SENs) means that each individual enzyme molecules are
surrounded by a three dimensional polymer layer. This polymer layer makes the enzyme more
stable than that of the nature ones and this layer c
an not limit the activity of the enzyme
seriously (the activity of the SEN
-
enzymes are about 45
-
70% of the nature enzymes but the
stability of the SEN
-
enzymes are about 50 to 80 times higher than the enzymes without
polymer layer

[2].We applied successfull
y our technique to stabilize thermophyl enzymes
from
Thermobifida fusca


-
D mannosidase, β
-
D
-
xylosidase, endomannanase and mutant β
-
D
mannosidase enzymes). For the stabilization of the enzymes we synthesized single enzyme
nanoparticles from different hemi
cellulose enzymes and after it we studied the activity and the
stability features of these enzyme nano
-
biocomposites.

During the fermentation of xylose and mannose β
-
xylosidase and β
-
mannosidase enzymes
build up as higher supramolecular structures (hypers
tructures). A hyperstructure is a large,
spatial association of cellular constituents such as molecules, macromolecules, and ions that
performs a particular function because the constituents are associated with one another. β
-
xylosidase enzyme has activity

only in a biner form but the tetramer form of β
-
xylosidase
enzymes can produce higher activity than that of the biner form of β
-
xylosidase enzymes. In
water media the well solved form of β
-
xylosidase enzymes build up a tetrameric quaterner
structure.

2.4.
Transmission electron microscopic visualization of the structure of cellulase enzyme
complex

I
MRE
H
EGEDÜS
1
,

E
NDRE
N
AGY
1

,

J
ÓZSEF
T
AKÁCS
2

3
RD
C
ENTRAL
A
ND
E
ASTERN
E
UROPEAN
P
ROTEOMIC
C
ONFERENCE
(CEEPC),

2009

OCT
.

06
-
09

B
UDAPEST
,

H
UNGARY

1
Research Institute of

Chemical and Process Engineering, FIT, University of Pannonia,
Egyetem u. 2., H
-
8200 Veszprém, HUNGARY

Tel.: +3688
-
624
-
040, Fax: +3688
-
624
-
038

2
Department of Anatomy, Histology and Embryology
, S
emmelweis University, 1094
Budapest, Tűzoltó u. 58. Phone: +36.1.459
-
1500, 215
-
692, Fax.: +36.1.215
-
5158 Ext.:
53600 Post addr.:1450 Budapest, Pf. 95.


E
-
mail: nagye@mik.vein.hu


We used a new technique to visualize the three dimensional structure of cellu
clast enzyme
complex. Celluclast (CK) is a supramolecular multifunctional multienzyme complex, with a
cellulase activity. To break the natural cellulose down to glucose monomers needs at least
four different types of enzyme. In the case of celluclast enzym
e complex there are not a
covalent binding between the individual enzymes but there is a non
-
covalent interaction
during the action of the multienzyme complex. Single enzyme nanoparticles (SEN) means,
that individual enzyme molecules were coated with a nan
ometer
-
scale polymer network in
order to increase their stability, providing longer lifetime of enzymes for biochemical
processes (Kim et al., 2006). This polymer nano
-
layer is thin and porous enough (Hegedüs,
Nagy, 2008) to allow practically unhindered di
ffusion of the substrate from the solution to the
active site of the enzyme, and unhindered transfer of the product from the active site to the
solution.

The structural and size characteristic of single enzyme nanoparticles of celluclast enzyme
complex (SE
N
-
CK), were detected by transmission electron microscopy (TEM). The
surrounding silica
-
containing nano
-
gel is electrodense and results dark corona around the
enzyme molecules on the picture. Using a very thin layer (50 % of the originally described
thickne
ss) we can see on the picture an enzyme strings and plan structures (likes a rhombus or
paralelogram) and it seems that there is a supramolecular structure of the enzymes. After the
preparation of SEN
-
CK the enzyme complex has biochemical activity (digest
the crystalloid
cellulose chains to glucose monomers). We supposed, that the function of the SEN
-
CK is
needed a natural three
-
dimensional structure of the enzyme complex. On the other hand the
polymer layer around the enzymes makes a more or less rigid str
ucture of the enzyme
complexes. So it means that the structure on the TEM detected picture of the SEN
-
CK is a
natural functional structure of the enzymes.

It is possible to wide the application of this technique to visualize other supramolecular
functional

units (hyperstructures).


2.5.
Improvement of the stability of hemicellulase enzyme nanobiocomposites

37
th

International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Slovakia, Tatranska
Matliare, 2010. máj. 24
-
28.

Imre HEGEDŰS, Endre NAGY

University of Pannonia, Research
Institute of Chemical and Process Engineering, Egyetem u. 10, 8200 Veszprém, Hungary,
phone: +36
-
88
-
624044, fax: +36
-
88
-
624038, nagy@mukki.richem.hu



Abstract:

Single enzyme nanoparticles (SENs) means that each individual
enzyme molecules
are surrounded by a three dimensional polymer layer. This polymer layer makes the enzyme
more stable than that of the

nature ones and this layer can
not limit the activity of the enzyme
seriously [1]. We stabilize thermophyl enzymes from
Th
ermobifida fusca


-
D mannosidase,
β
-
D
-
xylosidase, endomannanase and mutant β
-
D mannosidase enzymes). While the natural β
-
xylosidase enzyme lost its activity after 50 days on +4

o
C, the SEN
-

β
-
xylosidase remains
their activity after 120

days.


2.6.
TERÉZ B
ARNA, CSABA FEKETE, RITA ELEK, GYULA BATTA, GERGELY
CSEN
DES, ÁKOS TÓTH, JÓZSEF KUKOLYA (2010)
CHARACTERIZATION OF THE
HEMICELLULOLYTIC SYSTEM OF THE PLANT WALL DEGRADER MODEL
ORGANISM
THERMOBIFIDA FUSCA

ActaMicrobiologica et I
mmunologicaHungarica, 57: 8
-
9.

The thermophilicactinomycete,
Thermobifidafusca
, is the major degrader of plant cell wall in
compost piles due to its complex cellulolytic and hemicellulolytic systems. The multiple
secreted
T. fusca
cellulases have already been investigated but little is
known about its more
complex hemicellulolytic enzyme system. Based on genomic sequence analysis, four
xylanases (Xyl10A, Xyl10B, Xyl11C, BXyl) and two mannanases (BMan, Man5C) were
identified as part of the hemicellulolytic system of T. fusca strain TM51.
The genes encoding
the hemicellulases were overexpressed in
E. coli
host and the proteins were subjected to
extensive biochemical characterization. These hydrolases are modular proteins with a
conservative, TIM barrel type catalytic domain that belongs to
Clan A of Glycosyl Hydrolase
Families and act in a double displacement mechanism. The only exception is BXyl, whose
catalytic modul has a unique five
-
bladed b
-
propeller fold. The mechanism, how BXyl cleaves
the glycosidic bond, leads to the inversion of an
omeric configuration supported by our NMR
data. The extracellular hemicellulases (Xyl10A, Xyl10B, Xyl10C, Man5C) all randomly
hydrolyse internal bonds in hemicellulose chain liberating oligosaccharides made of up to 12
sugar units. These hydrolases are hyp
erthermostable enzymes as maintaining their catalytic
activity around 80°C. The intracellular BXyl and BMan attack xylo
-

and
mannooligosaccharides from the non
-
reducing end and remove monosaccharide units with
50°C temperature optimum. A synergistic relati
onship was detected among the
T.
fusca
endoxylanases (Xyl10A, Xyl10B) and b
-
xylosidase (BXyl), when they act in a concerted
manner on a largely insoluble xylan. Utilizing this effect, we have developed an enzyme
based kit comprising
T. fusca
xylanolytic enzy
mes for quantitative determination of xylan
content in plant cell wall. The stability of
T. fusca
hemicellulases is achieved partly by a
number of ion pairs that form on the surface of the proteins and by oligomerization.
Oligomerization is prevalent in the

active form of the intracellular enzymes (BXyl, BMan).
The endo acting
T. fusca
hemicellulases carry family 2 cellulose binding domain (CBM2),
which specifically bind to crystalline hemicellulose. The active site topology of the
intracellular hemicellulase
s (BMan and BXyl) was examined using two different approaches.
In case of BMan, the active site nucleophile was identified by site
-
directed mutagenesis. To
probe the active site of BXyl, a mechanism trap (N
-
brom
-
acetyl
-
xylopyranozyl
-
amine) was
employed tha
t is able to form covalent bond with exposed carboxyl side chains. In the ligand
binding channel, four amino acids with carboxyl groups were modified, which suggests a
unique arrangement of two Asp
-
Glu pairs.

This study was supported by the NKTH TECH_08
-
A
3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008)
MYCOSTOP grant


2.7.
MÁTYÁS CSERHÁTI, CSILLA KRIFATON, SÁNDOR SZOBOSZLAY, JUDIT
HÁHN, JÓZSEF KUKOLYA, BALÁZS KRISZT

(2010)
AFLATOXIN B1
DEGRADATION ACTIVITY OF SOIL BACTERIA ISOLATED FROM OIL POLLUTED
SITES

ActaMicrobiologicaetI
mmunologicaHungarica, 57: 15
-
16.

AflatoxinB1 is toxic and carcinogenic metabolite produced by species of
Aspergillusflavus
and
A. parasiticus
. Beside its cytotoxic effects it is one of the most powerful natural mutagenic
pollutants. The
refore it is not surprising that among mycotoxinsaflatoxin has far the lowest
regulatory limit


as low as 4 μg/kg (EFSA, 2006)


in food and feedstuffs. The total annual
worldwide loss due to aflatoxin in food and feed industry is up to billion Euro range
. In our
lab during the last decade oil degrader bacterial strains were isolated by the use of special
selection methods from oil contaminated sites of Hungary. Our microbial strain collection
contains about 300 different strains that are able to degrade d
ifferent hydrocarbon compounds
presented in oil polluted sites.

In a preliminary experiment 20 strains were selected according their excellent aromatic
hydrocarbon (PAH) degrading activity. As PAHs have similar structure to aflatoxinB1
(AFB1), these aroma
tic decomposer strains were chosen for mycotoxin biodegradation
experiments. Our aim was to monitor the biodegradation of AFB1 and to measure the
resulting genotoxic level of the degradation residuals by bacterial biotests. The AFB1
degrading activity of 2
0 selected strains, which were representatives of the genera
Pseudomonas, Streptomyces, Microbacterium, ArthrobacterPseudoxanthomonas, Gordonia,
Chryseobacterium, Paracoccus, Ochrobactrum
and
Sphingopyxis
were measured in
contaminated liquid cultures. AFB1 c
oncentration was 4 μg/ml in the starting media. The
residual mycotoxin levels were detected by ELISA and chemical analytical tests, respectively.
From the investigated 20 strains 18 could degrade AFB1 significantly. The best AFB1
degrader was
Pseudomonas p
seudoalcaligenes
with 98,5 % degrading activity. The genotoxic
effects of the degraded mycotoxin containing samples were analysed by SOS
-
Chromotest. We
found that the genotoxic effect of AFB1 is still detectable at 0,078 μg/ml concentration. SOS
-
Chromotest
was successfully used to select microorganisms that have the best AFB1
degrading potential and can degrade AFB1 without genotoxic by
-
products.

This study was supported by the NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008)
MYCOSTOP grant and KMOP 1.1.1.
-
07/1
-
2008
-
0002 project.


2.8.
Fekete Cs. A., Elek R., Batta Gy., Kukolya J., Kiss L., Barna T. :
A
Thermobifidafusca
fajból származó intracellulárisβ
-
D
-
xilozidáz enzim aktív centrumának
topológiai vizsgálata
,
A Magyar Biokémiai Egyesület 2010. évi Vándorgyűlése
,
2010.
augusztus 25
-

28. Budapest, Biokémia folyóirat, p23
-
24 (
ISSN 0133
-
8455)


A xilanázok növényi hemicellulózt bontó enzimek, amelyek jelenleg a világ biotechnológiai
enzimfelhasználásának közel 20%
-
át adják. A heterogén összetételű xilán teljes lebontá
sához
egy több enzimből álló enzimrendszerre van szükség, amelynek utolsó tagja a β
-
D
-
xilozidáz
(EC 3.2.1.37). A
Thermobifidafusca
β
-
D
-
xilozidázenzyme jellegzetes felépítésű, kizárólag β
-
redőkből álló moduláris fehérje, a katalitikus egység ötlapátos β
-
prop
eller, míg a
szénhidrátkötő doménβ
-
szendvics szerkezetű. 1H
-
NMR
-
vizsgálatokkal bizonyítottuk,hogy az
enzim a szubsztrátját (rövidláncú xilooligoszacharidok) inverziós mechanizmusszerint hasítja.
Termékgátlás volt megfigyelhetőxilóz esetén amelyet, STD 1H
-
N
MR
-
technikával,valamint
klasszikus kinetikai mérésekkel is meghatároztunk(Ki = 67 mM). Továbbá azt is
megállapítottuk,hogy az enzim aktív centrumában aglikon
-
kötőhely abszolút
szubsztrátspecifitást mutat.Az inhibíciós vizsgálatokból pedig az derült ki,hogy

az
aglikonkötődést nagymértékben elősegítika π
-
π kölcsönhatások, amikor az aglikonaril
-

vagyazidcsoport. A β
-
redős szerkezetnek köszönhetőenaz enzim nagy termostabilitású. A CD
spektroszkópiásmérések alapján ez a szerkezeti motívumtorzul, amikor
szubsztrá
tanalóginaktivátor(N
-
brómacetil
-
β
-
D
-
xilopiranozilamin) kötődik azaktív centrumba.
A
T. fusca
β
-
D
-
xilozidáz eseténnégy inaktivátor molekula kötődése vált bizonyítottáa
MALDI
-
TOF mérések során, arra utalva, hogyaz általánostól eltérően nem kettő, hanem
négyes
szenciális karboxilcsoport található az aktív centrumban.A módosított aminosavak
peptid térképezésseltörténő azonosítása folyamatban van. Egymásik megközelítéssel az
esszenciális karboxilátoldalláncok részvételét a szubsztrát hidrolízisében,specifikus reag
ensek
(
N
-
(3
-
dimetilamino
-
propil)
-
N

-
etil
-
karbodiimid, glicin
-
metil
-
észter) alkalmazásávalis
igazoltuk.

NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385(OM
-
00234/2008)


2.9.
PÉTER HARKAI, PÉTER VERES, MILÁN FARKAS, JÓZSEF KUKOLYA, SÁNDOR
SZOBOSZLAY, BALÁZS KRISZT
(2010)
SCREENING FOR NEW TAXA FROM ACTINOMYCETE
STRAIN COLLECTION BUILT IN THE EARLY SEVENTIES

ActaMicrobiologicaetI
mmunologicaHungarica, 57: 28.

Actinomycetes are one of the most significant prokaryote groups from a biotechnology aspect,
since they are used as
industrial sources of enzymes (hydrolases, transferases, esterases etc.).
Moreover, they represent an important group for the pharmaceutical industry, as they produce
a wide spectrum of antibiotics, as well as antifungal and antiviral substances. Thus, iso
lation
and identification of new actinomycete strains, and their screening for considerable industrial
properties have a great importance nowadays. Our aim was the molecular taxonomic
classification of the actinomycete strain collection of Agruniver Holdin
g Ltd. formed till the
beginning of 1970. We had limited information about the original strain collection as well as
the freeze dried microbe strains. Out of the strain collection that makes up circa 400 items, we
have already recultured and identified hun
dred strains by molecular methods on the base of
their 16S rDNA sequences analyses. In the PCR reaction 27f and 1492r universal primers
were used. Sequencing was performed with an ABI Prism 310 device, and leBIBI software
parallel with Blast analysis were
used for sequence based identification. On the base of our
findings, the major part (80%) of the identified strains belongs to the Streptomyces genus.
Besides actinomycetes, one
Ureibacillus
and two
Thermoactinomyces
species were also
identified. In this stu
dy, we report the description of a new species candidate
Streptomyces
strain. Strain K23 shared up to 97% similarity with sequences of its closest relative type
strains of
S. griseochromogenes
and
S. canarius
(97% homology). Interestingly, strain K23
shared
higher than 99% homology with
S. viridochromogenes
JCM 4437. Based on detailed
electron microscopic observations of spore morphology and the results of molecular
taxonomic investigations (cell wall
-
, quinone analysis, API 50CH, API ZYM), in which
S.
viridoc
hromogenes
DSMZ40110 type strain, JCM 4437 and strain K23 were compared, we
discovered that
S. viridochromogenes
JCM 4437 strain was originally misidentified by
phenotypic methods in the 1960s. DNA

DNA homology values between strain K23 and JCM
4437 was high
er than 80 %, while relatedness between strain K23 and
S.
viridochromogenes
type strain (DSMZ) was only 65%. Our results warranted the proposal of
strain K23 as the new species
Streptomyces küsteri
sp. nov, parallel reclassification of
S.
viridochromogenes
JC
M 4437, which also would be placed in this new taxon.

This study was supported by the NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008)
MYCOSTOP grant and KMOP 1.1.1.
-
07/1
-
2008
-
0002 project.


2.10.
CSILLA KRIFATON, JÓZSEF KUKOLYA, SÁNDOR SZOBOSZLAY, ÁDÁM
SZŰCS,

BALÁZS KRISZT

(2010)
NEW SCREENING METHODS IN MYCOTOXIN
BIODEGRADATION AND METABOLISM RESEARCH

ActaMicrobiologicaetI
mmunologicaHungarica, 57: 49
-
50.

Aflatoxins are the secondary metabolites of
Aspergillus
spp. Out of aflatoxins the B1 type is
the most hazardous that have mutagenic, carcinogenic, teratogenic, immunomodulant and
cytotoxic effects. This complex micropollutant can be found in food and feed as well, thus
representing environmental and health saf
ety problems. Therefore, detection and
biodegradation of this mycotoxin are getting more important nowadays.

Besides several advantages of biodegradation, application
-
risks of the bioprocess also exist.
Harmful cleave products are possibly created that ca
n not be followed up by traditional
methods. Parallel to expensive immunochemical and analytical methods biotests can be
alternative screening methods to examine degradation processes. For monitoring mycotoxin
degrading microbes we adopted a luminescence a
nd a colorimetric assay to analyse
cytotoxicity and genotoxicity of aflatoxin B1.
A. fischeri
luminescent bacterium is one of the
most sensitive ecotoxicological test
-
organism, however the standard test is not targeted at
mycotoxins. Nevertheless, a modifie
d
A. fischeri
method is suitable to detect aflatoxin B1 at as
low as 1 μg/ml range. In addition, the SOS
-
Chromotest is appropriate to detect aflatoxin B1
yet in 0,078 μg/ml, hence it can be proper for food and feed safety purposes as well. In
consequences t
hese biotests are relevant methods to improve biodegradiation processes and to
select the best mycotoxin degrading microbes with the less harmful end products. As these
methods are cost
-
effective and rapid systems, they are suitable tools to investigate my
cotoxin
metabolism and to create genetically improved microbe clones by screening mutagenesis
clone libraries. We adopted the
A. fischeri
system and the SOS
-
Chromotest to analyse
degradation potential of different microbes including
Rhodococcus, Brevibacter
ium,
Streptomyces, Pseudomonas, Microbacterium, Arthrobacter, Gordonia, Chryseobacterium,
Paracoccus, Pseudoxanthomona
and
Arthrobacter
species, respectively. We could successfully
select the best aflatoxin B1 degrading strains by the use of the two biotests
. Moreover our
results were confirmed by parallel chemical analytical and ELISA tests. Our results pointed
out the necessity of such biotests as remained cytotoxicity and genotoxicity were revealed
even after great toxin degradation. This finding also unde
rlines the importance of using
diverse biotests, since they analyse different effects: cytotoxicity and genotoxicity.

Based on these results we have already started a thorough screening project of thousands of
clones from UV
-

and transposon
-
mutagenesis cl
one libraries. Our aim is the selection of
clones with improved aflatoxin degradation ability and simultaneous identification of the key
enzymes.

This study was supported by the NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008)
MYCOSTOP grant and KMOP 1.1.1.
-
07
/1
-
2008
-
0002 project


2.11.
RÉKA SZÁNTÓ
-
EGÉSZ, FLÓRA SEBŐK, ÁRPÁD SZÉCSI, KLÁRA
DALLMANN:
DETECTION OF TOXINOGENIC
FUSARIUM
STRAINS IN PLANT
TISSUES BY MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS

ActaMicrobiologica et I
mmunologicaHungarica, 57: 80.

Several
Fusarium
species, which can be inhibited in soil, produce mycotoxins belonging to the
trichothecenes, such as deoxinivalenolt (DON), and other toxins e.g. zearalenon (ZEA) and
fumonisin (FB1). Fusariums in general can be found in the cereals grown in the temperate
zones of America, Europe and Asia.

Cereals can be infected by mycotoxin
-
producing moulds in Hungary. Wheat, barley and
maize give the two third of the world’s crop production and these plants are the most exposed
of
Fusarium
infection. These cultures take
significant parts of the sowing area of Hungary.
Food quality is highly influenced by the microbial factors of the food chain stage soil
-
plant
-
animal product. Occurrence of
Fusarium
toxins in products intended for animal consumption
can be harmful to any sp
ecies of animals and can cause significant damage in livestock
breeding what can be observed in the decrease of the ability of reproduction, the utilization of
fodder and the capability of resistance against the different infections. Even frequent diseases

and death can occur according to the quantity and type of mycotoxin. To prevent the
occurrence of
Fusarium
toxins in products intended for animal consumption or at least to
decrease it to the minimal level on behalf of the avoidance the negatively effect i
s highly
important. Beside the identification of
Fusarium
isolates on the base of phenotypical features
the development of fast and reliable molecular biological methods inclusively effective
detection of toxinogenic genes is also required. During our resea
rch, such a PCR method was
used that was suitable for the detection of toxinogenic fungi species by amplifying the genes
responsible for the production of toxins. The PCR reaction was optimized by testing the
efficiency of the primers in vitro, using isola
ted DNA from cultures of DON, zearalenone and
fumonisin producing species. Then we used these optimized PCR systems to test the DNAs
from different plant tissues infected with Fusarium in order to determine the sensitivity and
specificity of the PCR based
detection when used with different matrixes. The results are
compared with those concluded using classic isolation and fusario toxin detection techniques.

This study was supported by the NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008)
MYCOSTOP grant.


2.12.
S
zűcs Ádám: Az aflatoxin
-
b1 vizsgálatára alka
l
mas biológiai hatásmérésen alapuló
módszerfejlesztés, OTDK, Biológiai Szekció, 2011. Április 19
-
21, Budapest, OTDK
Nyertes pályázat


Amikotoxinok, a gombák másodlag
os anyagcsere termékei, amelyek
karcinogén, mut
agén,
teratogén, immuns
zupresszív, illetve citotoxikus
tulajdonságai miatt, élelmiszer és
környezetbiztonság
i szempontból is egyre
kiemeltebb figyelmet igényelnek. A m
ikotoxinok
eliminálásának egyik
lehetséges módszere a biodegradá
ciós eljárások alkalmazás
a. Már
kereskedelmi forgalomban is kaphatók
mikroba eredeti mikotoxin
-
bontó
enzimen alapuló
takarmány kiegész
ítők, és jelentek már meg olyan
publikációk, amelyek a különböző
mikotoxi
nok degradálására képes mikroba
törzsek izolálását és szkreene
lését taglal
ják.
Azonban ezek a
biodegradációs folyamatok rejthetnek kockáz
atot is: ugyanis a metabolizmus
során keletkezhetnek olyan közti
-

illetve melléktermékek, amelyek
toxikusabbak is lehetnek,
mint az eredeti

vegyületek, másrészt egymással
kölcsönhatásba lépve n
ehezen követhető
fol
yamatokat indíthatnak el, amely
interakciók termékeit hagyományos detektálási
módszerekk
el felderíteni
szinte lehetetlen. A költséges és k
orlátozott kimutatási képességű
analitikai mérések mellett fontos szere
pet kaphatnak olyan biotesz
tek,
amelyek lehetőséget
nyújtanak a biodegr
adáció indirekt mérésére, és ez
által olyan mikrobák kiválasztására,
amelye
k toxikus melléktermékek nélkül
képes
ek a mikotoxinok eliminálására.

Munkám célja egy olyan módszer kido
lgozása volt, amellyel az egyik
l
egveszélyesebb
mikotoxin, az aflatoxin B1
biológiai hatását mérhetjük, és
amellyel lehetőségünk van kiváló
bon
tási potenciállal rendelkező, a
biodegradációt káros mellékterméke
k nélkül végző
mikroszervezetek
szelektálására. Az aflatoxin B1 genotoxikus

tula
jdonságának mérésére
ugyan
rendelkezésre állnak mutagenitási tesztek (A
mes
-
teszt, SOS
-
Chrmotest), de a
genotoxicitás mellett ennek a vegyületne
k közismert az erős citotoxikus
hatása is. A
citotoxicitás mértékéne
k megállapítására az
Aliivibrio fischeri

biolumineszcens baktériumot

használtuk tesztszervezetként.
Optimális körülmények között a baktérim fényt bocsájt

ki,
szennyező anyag
hatására azonban csökkenti ezt a tevékenysé
gét. A tesztszervezet a szerves
szennyező
k széles körére reagál, viszont a t
oxi
nokra mutatott érzékenységét
még alig
vizsgálták. Laboratóriumi kísérleteink során megállapítottuk az
A. fischeri

érzékenységét
aflatoxinra, a to
xin mérésére leginkább alkalmas
kontaktidot és a hatásos konce
ntráció
értékeket (EC értékek).
Munkánk során az
A. fischeri lumineszce
ncia gátlás módszerét
sikeresen
adaptáltuk az aflatoxin B1 biodegradációját toxikus hatás v
isszamaradása
nélkül
bontó mikrobatörzsek kiválasztására.
. A biodegradációs tesztekben a
toxinbontás hatásfokát
párhuzamos
an végzett kémiai ana
litikai és
immunanalitikai (ELISA) tesztekkel

is
minisítettük. Vizsgálataink
rávilágítottak arra a tényre, hogy a kémiai
-

és immunanalitikai
mérésekkel
sikeresnek mondható aflatoxin bontás után

is lehetséges toxikus termékek
visszamaradása. Ezen eredményün
k hangsúlyo
zza az ökotoxikológiai tesztek,
azaz a biológiai
hatás mérésének szerepét a kémiai analitikai és ELISAtesztek mellett.


Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az NKTH TECH_08
-
A3/2
-
2008
-
0385 (OM
-
00234/2008) MYCOSTOP

project és a KMOP 1.1.1.
-
07/1
-
2008
-
0
002 project támogatta.


2.13.
Biomonitoring módszerek fejlesztése mikotoxinok vizsgálata céljából

(2011,
Tehetség nap, SZIE, Gödöllő),
Szűcs Ádám, Krifaton Csilla

Szent István Egyetem,
Környezetvédelmi és Környezetbiztonsági Tanszék

Abstract:
Az aflatoxin
-
B
1, az egyik legveszélyesebb mikotoxin, amit az
Aspergillus

gombafajok termelnek másodlagos anyagcseretermékként. Az aflatoxin eliminációjára
alkalmas biodegradációs eljárások alapvető feltétele olyan mikrobák szelektálása, amelyek
hatékonyan, környezet
-
egé
szségügyi szempontból biztonságosan képesek a mikotoxin
bontására. A költséges és korlátozott kimutatási képességű analitikai mérések mellett fontos
szerepet kaphatnak olyan biomonitoring módszerek, amelyek lehetőséget nyújtanak az
aflatoxin indirekt mérés
ére, és screening módszerek kifejlesztésére, amellyel kiválaszthatóak
az aflatoxin bontására káros melléktermékek nélkül képes mikroszervezetek.

Munkánk célja az aflatoxin B1 monitoringjára alkalmas biológiai hatásmérésen
alapuló módszer fejlesztése, és annak adaptálása mikotoxin
-
bontási kísérletekhez.
A
vizsgálathoz az
A
liivibrio

fischeri

tesztszervezetet alkalmaztuk,

a szerves szennyezők széles
k
örére reagál, viszont a toxinokra mutatott érzékenységét még alig vizsgálták.

Laboratóriumi kísérleteink során megállapítottuk az alkalmazott
A. fischeri

módszerrel
az aflatoxin
-
B1 esetében a hatásos koncentráció értékeket (EC értékek) és a kimutathatóság
i
határt. A tesztet sikeresen adaptáltuk az aflatoxin
-
B1 toxint citotoxikus hatás visszamaradása
nélkül bontó mikrobatörzsek kiválasztására.

A biodegradációs tesztekben a toxinbontás
hatásfokát párhuzamosan végzett kémiai analitikai

(HPLC)

és immunanalitikai (ELISA)
tesztekkel is minősítettük. Vizsgálataink rávilágítottak arra a tényre, hogy
hatékony

aflatoxin
bontás után is lehetséges
cito
toxikus termékek visszamaradása. Ezen eredményünk
hangsúlyozza a biológiai hatásmérés
en alapuló teszte
k

szerepét a kémiai anali
tikai és ELISA
tesztek mellett.

Kulcsszavak
:

aflatoxin
-
B1,
Aliivibrio fischeri
, biodegradáció