Janvier 2002 - Inra

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Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Ces hybrides ont généralement des degrés très divers
de"fitness",et il est vrai que c'est plutôt dans la
gamme basse que se situe la moyenne. Certains
génotypes hybrides sont, cependant, plus performants
que ceux des parents, même dans l'habitat des parents
(heureusement pour les semainiers).
La revue de MJ Burke et al.; Annual Review or
Gene Tics 35 (2001) 31-52, analyse les causes
génétiques de cette infériorité des hybrides (stérilité
et non-viabilité) y compris chez les plantes. Ceci
implique, évidemment, celle de la supériorité de
certains hybrides (vigueur hybride).
Les résultats de cette analyse indiquent que
l'épistasie négative dans un contexte hybride joue un
grand rôle dans l'infériorité.C'est cependant un
élément controversé depuis que l'hypothèse a été
avancée par Sewall Wright et RA Fisher dans les
années 30 s. La question est de savoir si la sélection
joue sur des ensembles de gènes co-adaptés (Wright,
Dobzhansky) ou sur des gènes isolés (Fisher). La
supériorité est liée à la ségrégation de facteurs
génétiques additifs, l'épistasie ne jouant qu'un rôle
modeste.
Il faut cependant remarquer que l'introgression (le
transfert d'un gène par hybridation) est un phénomène
très fréquemment constaté chez les plantes et les
animaux à l'échelle évolutive. Elle est le témoin d'une
hybridation, mais aussi d'une forte sélection,
permettant une supériorité de l'hybride, au moins dans
certains habitats. Ce qui indique donc une source de
variations génétiques adaptatives.
Cette sélection peut être de type endogène
(indépendante de l'habitat).La sélection endogène est
une conséquence d'anomalies de la méiose ou de
régulations du développement.Elle peut être exogène
et dépend de l'environnement.
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7. La réparation de l'ADN est un phénomène
complexe.On peut ajouter à cette complexité
l'intervention de l'ubiquitine,plus connue pour son
rôle dans le ciblage des protéines devenues inutiles
vers la dégradation.CMPicquart; Nature 419
(12SEP02) 120-121.
On savait depuis une dizaine d'années que le
marquage par l'ubiquitine peut être interprété par la
cellule de façons variées. Or c'était à propos de la
protéine Rad6 qui jouait, à la fois, un rôle dans la
réparation de l'ADN et dans la destruction des
protéines, en servant de coadjuteur à l'ubiquitine. Mais
on ne connaissait pas les cibles, et donc le rôle
biologique de ce complexe.
C Hoege et al.; Nature 419 (12SEP02) 135-141
viennent de montrer que la protéine PCNA
(Proliferative Cell Nuclear Antigen) est l'une de ces
cibles. Cette protéine intervient lors de la relance
d'une réplication arrêtée par une coupure simple
brin. ###
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Les Productions Végétales
Les gènes et les génomes
9.Mitochondries et chloroplastes sont les
résultats de symbioses intracellulaires ayant amené
une réduction du génome bactérien. Les
cyanophycées, à l'origine des chloroplastes,
possèdent de 1694 (Prochlorococcus) à 7281
(Nostoc) gènes contre 58 à 200 gènes pour les
chloroplastes.Un commentaire passionnant est paru
sur les mouvements des gènes entre chloroplaste et
noyau avec B Palenik; Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 99 (17SEP02) 11996–
11997,s'appuyant sur l'article d'un groupe de
chercheurs allemands (dont une équipe de Bayer)
W Martin et al.; p.12246–12251.
La greffe de peptides signaux a permis un retour
de certaines des protéines vers le chloroplaste, après
le codage nucléaire et sous régulation par le noyau.
L'article de MW Martin et al.insiste sur un point
méconnu, le rôle de tous les gènes de "ménage",
devenus inutiles pour la cyanobactérie symbiotique,
dans l'évolution de la plante,les produits de ces
gènes ne retournant plus vers le chloroplaste. Cette
réduction du génome chloroplastique continue.
On trouve, chez Arabidopsis et parmi les 24 990
gènes prédits, et 9368 pouvant être analysés sur le
plan phylogénétique,1700 gènes seraient très
probablement d'origine cyanobactérienne. C'est
presque le nombre total de gènes d'un
Prochlorococcus. B Palenik critique, cependant,
l'exploitation de ce résultat pour extrapoler au reste
du génome d'Arabidopsis.
Les fonctions, dans la cellule végétale, des gènes
"perdus"par le chloroplaste sont analysées dans un
tableau de l'article de W Martin. On les retrouve dans
le métabolisme et la transcription et la division
cellulaire.
La nature continue des expériences dans ce sens
avec des symbioses emboîtées secondaires et
tertiaires (Dinoflagellés) où des algues deviennent
des symbiotes d'autres eucaryotes. Les diatomées en
sont un exemple, où les restes d'une algue rouge joue
le rôle de chloroplaste. C'est d'ailleurs le cas de ce
que l'on appelle les cryptophytes. Le génome du
nucléomorphe (le reste d'une algue rouge observable
dans le chloroplaste des cryptophytes) a été séquencé
(S Douglas et al.; Nature 410 (26APR01) 1040-
1041).Même Plasmodium falciparum contient les
restes d'un chloroplaste. (voir le site
www.jgi.doe.gov/JGI.microbial/html/index.html).
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10. On trouvera dans TMGottlieb et al.; BioEssays
24 (AUG02) 685-689, une étude du rôle de la
variabilité génique cryptique dans la
domestication du maïs basée sur l'article de
N Lauter et al.; Genetics 160 (JAN02) 333–342.
Cette variabilité peut entraîner un phénotype
détectable dans certaines conditions. ###
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Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
L'expression génique
11. On trouvera dans MWRhoades et al.;Cell 110
(23AUG02) 513–520, la description des cibles des
microRNAs (miRNAs) chez Arabidopsis. Ces
miRNAs (voir le §1) donnent lieu à un appariement
imparfait avec les régions non traduites 3' de leur
cible. Mais, à part deux de ces ARNs fonctionnant
durant le développement chez Caenorhabditis, on ne
connaît la fonction d'aucun d'entre eux. Il semble que,
chez les plantes, ce soient essentiellement les gènes de
facteurs de transcription et que, comme pour les
siRNAs (voir le Bulletin de Juillet §10), ils
provoquent une destruction de l'ARN cible.On a
récemment caractérisé miR171, un miRNA
parfaitement complémentaire des prémessagers de
trois facteurs de transcription SCARECROW-like
(C Llave et al., Science 297 (20SEP02) 2053-2056 et
BJ Reinhart et al.; Genes & Development 16
(01JUL02) 1616-1626). Chez les plantes, il semble
bien que la complémentarité soit très forte,ce qui
facilite la détermination des cibles.
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La méthylation de l'ADN dépend de celle de la
lysine 9 de l'histone 3 de sorte que cette modification
entraîne une hérédité épigénétique, une fois établie.
La méthylation de la lysine 4 de l'histone 3 est
associée à une chromatine active, alors que celle de la
lysine 9 est associée à une chromatine inactive.
Des chercheurs d'Evry et du Cold Spring Harbor
Laboratory,avec R.Martienssen, montrent que si le
gène DDM1 d'Arabidopsis est nécessaire à la
méthylation de l'ADN et que, de ce fait, il est
indispensable à la répression de l'expression des
transposons et de transgènes, il code une protéine
de type SWI/SNF. Or ces protéines sont des
complexes d'environ 15 sous-unités qui sont des
modulateurs ATP-dépendant de la chromatine.Ils
fonctionnent comme une ATPase géante ADN-
dépendante. Ils favorisent la fixation de facteurs de
transcription sur les promoteurs au sein des
nucléosomes. Le gène DDR a donc très certainement
un rôle indirect dans la méthylation.AV Gendrel et
al.; Science 297 (13SEP02) 1871-1873.
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12. L'US Patent n°6 452 067 (17SEP02) de DNA
Plant Technology décrit un technique de détection
des phénomènes de PTGS (Post-Transcriptional Gene
Silencing) pour un gène donné. Le PTGS peut,en
effet,être utilisé à la fois pour détecter les cellules où
il sera gênant ou, au contraire, celles où on a bien
inactivé (au moins partiellement) une fonction. Il faut,
par ailleurs être sûr que c'est le PTGS qui est en cause
dans une baisse d'expression.
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Le développement
13. La germination de la graine est stimulée par la
gibbérelline (GA), qui joue un rôle de régulateur de
croissance chez beaucoup de plantes.
L'embryon est arrêté dans son développement, et
des stimuli environnementaux viennent relancer la
croissance. L'acide abscissique (ABA) est un facteur
endogène impliqué dans l'établissement ou le maintien
de la dormance, tandis que GA l'est dans l'induction
de la germination.
En réalité, si on beaucoup étudié la germination
chez Arabidopsis,la tomate,le tabac et les céréales, ce
sont plutôt les conséquences de la germination que
l'on a explorées. Le rôle du GA dans le
déclenchement de la germination des céréales est
encore énigmatique, mais il est clairement démontré
chez les trois autres plantes.
On ne connaît que très peu de facteurs répondant au
GA.La famille GAI (GA insensitive) comprend cinq
membres très apparentés.GAI,RGA (R
epressor of
ga
1-3) et RGL1 (pour RGA-like) sont des régulateurs
négatifs de la croissance, tandis que RGL2 et
probablement RGL1 sont des régulateurs négatifs de
la germination.
On pu établir que RGL1 partiellement redondant
avec GAI et RGA dans la répression de l'élongation
de la tige, mais qu'il joue également un rôle
manifestement différent dans la germination. Des
mutations impliquant une perte de fonction de RGL2
rétablissent complètement la germination,en
l'absence de GA, chez des mutants ga1-3. Elles ne
rétablissent pas le phénotype nain de ces mutants,ce
qui souligne le rôle particulier dans la seule
germination.Il semble que la protéine RGL2 puisse
jouer un rôle intégrateur des signaux endogènes et
environnementaux lors de la germination.
Il existe chez Arabidopsis,plusieurs protéines
porteuses du motif DELLA qui sont des répresseurs
de la division cellulaire et de l'élongation dans la tige,
ainsi qu'au cours de la germination.GA régule les
trois mécanismes en s'opposant aux protéines
DELLA. Chez les céréales, le nombre de ces
dernières est réduit avec une seule protéine codée par
les génomes du riz et de l'orge (SLN-1) qui est
impliquée dans la réponse de l'aleurone, mais pas
forcément de la germination.J Peng et al.; Current
Opinion in Plant Biology 5 (AUG02) 376–381.
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Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
La Physiologie des Plantes
14. Les brassinostéroïdes (BRs) sont des
polyhydroxystéroïdes intervenant dans le
développement des plantes.
L'action, chez les animaux, des signaux stéroïdiens
comporte une action directe de récepteurs liés à leur
ligand dans la transcription. On n'a pas trouvé trace de
tels récepteurs chez les plantes. Le seul récepteur
connu est membranaire,c'est la sérine/thréonine
protéine kinase BRI1 (BRassinosteroid Insensitive 1).
La protéine récepteur BRI1 contient, dans son
domaine extra-cellulaire,25 répétitions riches en
leucines (LRR) séparées par un îlot unique de 70
aminoacides entre la 21° et la 22° répétition (LRR-
RLK). Elle contient un unique domaine
transmembranaire,puis le domaine protéine kinase
cytoplasmique. Les mutants de ce récepteur sont
insensibles aux BRs.
On vient de montrer, dans un système à deux
hybrides, que le gène BAK1 (B
RI1 A
ssociated
receptor K
inase 1, une LRR-RLK distincte de BRI1)
d'Arabidopsis code une protéine partenaire de BRI1.
KH Nam et al.; Cell 110 (23JUL02) 203-212 et L Li et
al.; p. 213-222.###
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15. Les petites protéines Heat-shock (sHsps de
taille comprise entre 15 et 42 kDa) répondent à un
choc thermique. Toutes possèdent un domaine -
cristalline C-terminal (ACD) conservé de 90-
aminoacides. Une revue du groupe de Van Montagu
fait le point sur ces protéines.WSun et al.;
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene
Structure & Expression 1577 (19AUG02) 1-9.On
trouvera également une revue sur l'acclimatation aux
fortes températures dans K Iba; Annual Review of
Plant Biology 53 (2002) 225-245, ainsi qu'une revue
sur le rôle des facteurs de transcription dans les
réponses aux stress dans KB Sing et al.;Current
Opinion in Plant Biology 5 (AUG02) 430-436..
Les plantes sont abondamment pourvues en de
telles protéines (probablement du fait de leur
environnement très changeant auquel elles ne peuvent
pas grand chose) et on en dénombre 19 gènes
potentiels chez Arabidopsis.
On admet,mais on n'a pas toujours prouvé, leur
rôle de chaperones. Elles peuvent également
intervenir lors d'autres types de stress (un tableau de
l'article de WSun et al. résume leurs propriétés
additionnelles).En l'absence de stress on trouve une
expression,notamment au cours de certaines phases
du développement, comme l'embryogenèse ou la
formation du pollen.
Leur production est régulée par des facteurs de
transcription particuliers, les HSFs (Heat Stress
transcription Factors). L'ingénierie des sHsps ayant
été tentée,mais sans avoir jamais pu obtenir des gains
de fonctions, on s'est tourné vers la régulation par les
HSFs. On a démontré le rôle protecteur, chez des
bactéries, des sHsp exprimées en permanence du riz,
du châtaignier et de la carotte, mais pas de façon
évidente chez les plantes,car on a alors également
exprimé en permanence Hsp70 qui risque de masquer
certains effets.
On trouvera dans KB Singh et al.; Current Opinion
in Plant Biology 5 (AUG02) 430-436, une revue sur
les facteurs de transcription intervenant dans la
réponse aux stress. Elle souligne,aussi,les
recouvrements entre voies de réponses. ###
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16. On trouvera dans O Leyser; Annual Review of
Plant Biology 53 (2002) 377-398, une revue sur les
diverses cascades de transduction du signal de
l'auxine. Elle complète celle de GF Scherer; Plant
Molecular Biology 49 (JUN-JUL02) 357-372,
mentionnée dans le Bulletin de Septembre §21). Une
cible fréquente de ces voies est la dégradation de
nombreux facteurs de transcription.
La seule protéine qui ait une chance raisonnable
d'être un récepteur de l'auxine est ABP1.C'est une
glycoprotéine homodimérique de 163 aminoacides.
La partie de la protéine responsable de la
reconnaissance de l'auxine a été établie (voir le
Bulletin d'Octobre 2001 §21). Mais c'est quand même
un récepteur original car la protéine reste
essentiellement retenue dans le réticulum ou le pH
est trop haut pour qu'elle y reconnaisse l'auxine.
Seule sa forme de surface est fonctionnelle. La
manipulation de son abondance ne change pas grand
chose.
Le gène AUX1 d'Arabidopsis code
vraisemblablement une auxine perméase important
l'auxine grâce à l'énergie des gradients de protons.
L'auxine intracellulaire est importante dans le cas
de l'inhibition de la croissance racinaire.
On a pu isoler, chez Arabidopsis,des mutants ayant
une sensibilité altérée à l'auxine. Parmi eux, on peut
citer six mutations qui définissent les gènes AXR1,
AXR2,AXR3,AXR4 et AXR6 ainsi que TIR1 dont les
mutations confèrent une résistance à l'auxine. AXR1 à
–3 ainsi que TIR1 fonctionnent dans le turn-over de
protéines par la voie de l'ubiquitine.
TIR1 est effectivement une protéine dite à F-box.
Elle participe à un complexe de l'ubiquitine ligase
SCF dit SCF
TIR1
[pour S
KP1 (suppressor of
kinetochore protein 1), C
ullin/CDC53,F
-box protein]
similaire à celui décrit chez la levure pour la
régulation de la voie de signalisation concernant les
acides aminés captés par le récepteur perméase Ssy1.
AXR2 et AXR3ont été définis par les mutations
dominantes tous deux codent des protéines de la
famille Aux/IAA qui sont caractérisées par quatre
domaines très conservés, avec un domaine II
indispensable à leur fonction, mais aussi à sa
déstabilisation.Arabidopsis possède 24 de ces
protéines. Toutes ces protéines sont nucléaires, et ont
une vie très courte qui est indispensable à leur
fonction. Cependant le mécanisme par lequel l'auxine
module l'activité de SCF
TIR1
sur les Aux/IAA n'est pas
évident. Leur instabilité est communicable à une
protéine marqueur fusionnée. Elles doivent donc
posséder un marqueur de dégradation (degron pour
les savants). C'est une séquence de 13 aminoacides
du domaine II.
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Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Il existe, par ailleurs, des possibilités de moduler
l'action de SCF
TIR1
via des protéines interagissant
avec SCF. On sait également que la conjugaison de la
protéine ubiquitin-like RUB1 avec la culline (le C
de SCF) accroît l'activité de SCF. Chez la levure, la
cible de Rub1p est Cdc53p, un des composants du
complexe ubiquitine-protéine ligase. Rublp-Cdc53p
est stable, indiquant que cette interaction a un rôle
stabilisateur (donc régulateur) plutôt que de ciblage
vers la protéolyse.
La fonction de SCF comporte des cycles de
conjugaison-séparation de RUB1. RUB1 doit
intervenir dans l'activité de SCF, mais pas dans
l'interaction avec sa cible.
Le rôle de la dimérisation des protéines Aux/IAAs
est encore l'objet de débats. La seule protéine qui peut
s'hétérodimériser avec elles est ARF (Auxin Response
Factor).Arabidopsis en possède au moins dix. Ils se
lient à des séquences des régions régulatrices des
gènes répondant à l'auxine, les AREs (Auxin
Response Elements). Les ARFs associent aux
domaines III et IV (qui permettent, comme chez
Aux/IAA,une dimérisation) un domaine se liant à
l'ADN remplaçant les domaines I et II des Aux/IAAs.
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17.Le groupe de Willmitzer et Sungene (qui lui y
est lié) viennent de caractérise un mutant
d'Arabidopsis incapable de produire le tocophérol
(vitamine E, antioxydant très convoité).S Porfirova
et al.; Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 99 (17SEP02) 12495-12500.
Les plantes sélectionnées décrites dans cette
publication manque des quatre tocophérols. Elles
sont déficientes dans leur activité tocophérol cyclase.
Le groupe a caractérisé la séquence du gène, VTE1,
qui présente une mutation dans un site d'épissage
associée à une déficience dans le niveau d'expression.
L'expression de VTE1 chez Escherichia coli entraîne
l'apparition d'une forte activité tocopherol cyclase et
tocotriénol cyclase. Cette séquence ne ressemble qu'à
celle de SXD1 (Sucrose eXport Defective 1) du maïs.
Curieusement les mutants vte ne sont pas
handicapés,et les tocophérols ne doivent donc pas
jouer, contrairement aux attentes, de rôle
indispensable dans la résistance aux stress oxydatifs.
Il existe, certes, mais à un niveau modeste.###
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19. L'US Patent n°6 451 581 (17SEP02) de du Pont
de Nemours couvre les séquences d'une série
d'enzymes impliquées dans la synthèse des acides
aminés ramifiés : dihydroxyacide déshydratase,
l'amino acid aminotransférase et les sous-unités leuC
et –D de la 3-isopropylmalate déshydratase. Le brevet
couvre les séquences sens et antisens ainsi que des
séquences chimériques pouvant être utilisées pour
moduler l'expression.
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Les Symbioses
20. Les polysaccharides extracellulaires (EPSs)
produits par Sinorhizobium meliloti sont importants
lors de l'établissement de la symbiose avec la
luzerne. L'absence de ces polysaccharides, si elle
laisse la possibilité de former des nodules, ceux-ci
sont inefficaces, car ils ne sont pas colonisés par les
mutants. N'importe lequel des trois polysaccharides,
succinoglucane, EPS II ou antigène K, permet cette
invasion. Mais il y a de subtiles différences entre ces
trois polysaccharides de ce point de vue.
Leurs structures sont différentes; Le
succinoglucane comporte des répétitions d'un
galactose suivi de sept glucoses modifiés par
pyruvylation, acétylation et succinylation. EPS II est
constitué de répétitions de galactoglucanes modifiés
par acétylation et pyruvylation). Quant à l'antigène K
il est constitué de répétitions d'un disaccharide
d'acides glucuronique et 5,7-diamino-3,5,7,9-
tétradésoxynonulosonique (ouf!). Ce sont les formes
à faible masse moléculaire qui sont actives.
La souche de laboratoire Rm1021 de S.meliloti
(celle qui a été récemment séquencée) produit des
quantités mesurables de succinoglucane, mais peu
d'EPS II, et pas du tout d'antigène K. On peut
provoquer la production d'EPS II par certaines
mutations ou par une croissance en carence de
phosphate.
Ainsi la mutation spontanée expR101 chez Rm1021
(dans le groupe de gènes exp de production d'EPSII),
qui entraîne une forme mucoïde des colonies, permet
la production d'EPSII actif, mais également de formes
à hautes masses moléculaires. L'inactivation du
gène mucR et une carence en phosphates permet une
production d'EPSII, mais de haute masse
moléculaire.
Le groupe de gènes exp en comporte 21 en 5 unités
transcriptionnelles :expA (avec 9 gènes),expC (1
gène),expD (2 gènes), expE (8 gènes) et expG (1
gène). Mais, parmi les produits de ces gènes, on
trouve des protéines dont on se demande ce qu'elles
viennent faire là, notamment 5 glycosyltransférases,
alors qu'on n'a que deux sucres répétés.Ce qui serait
quand même intéressant, serait de savoir comment est
régulée la longueur des polysaccharides, car cela
semble important pour l'activité, et comment sont
régulées les nombreuses modifications des sucres car
on ne trouve pas de gènes évidents dans ce domaine.
En ce qui concerne les régulations, on sait que le gène
mucR est un régulateur négatif de la production
d'EPSII et positif de celui du succinoglucane.
On vient de montrer que la production d'EPSII
fonctionnel dépend du gène régulateur expR, celui
qui est affecté dans la mutation expR101.BJ Pellock
et al.; Journal of Bacteriology 184, n°18 (SEP02)
5067-5076.###
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Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
21. Le "quorum sensing" est associé avec la
régulation de nombreuses propriétés biologiques chez
les bactéries gram-. On cherche donc à interférer avec
ces signaux,notamment pour gêner la virulence (voir,
par exemple, le Bulletin d'Octobre 2001 §34). Le
signal peut être utilisé positivement. Mais il existe
manifestement d'autres signaux entre cellules (voir le
Bulletin de Novembre 2001 §21 et de Mars §115). On
vient de montrer que plusieurs dipeptides cycliques
(dicétopipérazines) sont produits par Pseudomonas
putida WCS358 qui est une des bactéries promoteurs
de croissance des plantes.Ces peptides activent les
systèmes classiques basés sur des biocapteurs utilisés
pour détecter les messages extra-cellulaires à base
d'acyl-homosérine lactones (AHLs). Des dipeptides
détectés ont déjà été signalés chez Pseudomonas
aeruginosa (MT Holden et al.;Molecular
Microbiology 33 (SEP99) 1254-1266). Ils peuvent,
soit activer les récepteurs d'AHLs, soit s'y opposer.
Dans le cas de Ps.putida on constate un dialogue entre
ce système et avec le système LuxI (AHL synthase) et
LuxR (régulateur). G Degrassi et al.;Current
Microbiology 45 (OCT02) 250-254.) 250-254.
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22.Un article de V Wiemken et al.;Current Opinion
in Plant Biology 5 (AUG02) 355-361, est consacré à
l'établissement de la symbiose mycorrhyzienne. Les
auteurs, du Botanisches Institut de Basel, discutent,
notamment, des modifications de l'expression
génique lors de l'établissement de cette symbiose.
Une remarque intéressante est l'existence de "ponts"
entre les arbres mycorrhizés par l'intermédiaire des
hyphes du champignon, qui a probablement un rôle
dans l'écologie forestière.
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Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense
23.Le numéro de Current Opinion in Plant Biology
5 (AUG02) est, en effet, consacré aux interactions
entre plantes,herbivores,pathogènes et organismes
mutualistes.
A Maule et al.; p.279-284, de Norwich, discutent du
dialogue entre les virus et leurs hôtes dans des
systèmes compatibles (où le virus peut se multiplier).
Ils analysent les régulations très strictes qui se
développent dans ce cas.
Les échanges entre microbes et plantes aux stades
initiaux d'une infection sont analysés dans J Loh et
al.; p.285-290, de l'University of Missouri.On
retrouve ici, encore, l'intervention du "quorum
sensing", cette fois dans le cas des colonisateurs de la
surface des plantes. Un point intéressant est
l'émission par les plantes de substances mimant les
AHLs et des enzymes dégradant les AHLs. Les
plantes essayent donc de manipuler ces échanges
entre bactéries.
T Nürnberger et al.; p.318-324, de Halle
Universität,s'intéressent aux progrès des
connaissances dans le domaine de la reconnaissance
des pathogènes. Les défenses innées des plantes
commencent à être comparées avec celles des
animaux. On y retrouve la reconnaissance de motifs
particuliers, relativement globaux, des pathogènes
(dont les éliciteurs), pour lancer des défenses peu
spécifiques mais efficaces. Le rôle de récepteurs
comme Toll est abordé. Au fond il n'est pas étonnant
que de tels mécanismes soient très anciens par rapport
aux mécanismes, hautement élaborés et coûteux en
gènes, de l'immunité adaptative.
U Wittstock et al.; p.300-307, du Max Planck
Institüt de Jena, s'intéressent aux défenses
permanentes qui permettent de compléter les
défenses inductibles.Parmi les défenses plus ou moins
permanentes on peut citer les mélanges de toxines. On
n'a, cependant, que peu de preuves directes d'un rôle
important de ces métabolites secondaires. La revue
s'intéresse, en parallèle,aux stratégies des attaquants
(pathogènes et herbivores) pour éviter ces toxines.
Les réponses de défense des plantes sont par
K Ramonell et al.; p.291-294 de Carnegie Institution à
Stanford.Cette revue porte sur l'utilisation des
multiples outils modernes d'analyse en masse.Les
auteurs soulignent que beaucoup de mécanismes
utilisés sont communs à la réaction aux stress
environnementaux et aux défenses contre les
pathogènes. On commence à décrire les protéines
impliquées.
L'un des mécanismes dirigé contre les organismes
pathogènes est celui des protéines inhibant les
polygalacturonases (PGIPs) pariétales. Les
recherches dans ce domaine sont analysées par G De
Lorenzo et al.; p.295-299, de La Sapienza à Roma.
Ces inhibiteurs ont une propriété complémentaire avec
la production d'oligogalacturonides à longues
chaînes qui induisent les réactions de défense.
AMLaxalt et al.; p.332-338 du Swammerdam
Institute d'Amsterdam, s'intéressent aux seconds
messagers lipidiques dans les défenses après
détection des éliciteurs des pathogènes.Les signaux
liés aux phospholipases C, -D et -A2, et leurs cibles
probables sont analysées.Les phospholipases
produisent des acides gras libres qui semblent être,
soit directement compris comme un signal
d'effraction par des pathogènes, soit être convertis en
oxylipines comme l'acide jasmonique.
La revue de BN Kunkel et al.;p.325-331 de
Washington University revient sur les interactions
multiples entre les voies des acides salicylique,
jasmonique et de l'éthylène. Les deux premiers ont
des activités antagonistes,comme on le sait, et ceci
permet d'ajuster la réponse.
P Potin et al.; p.308-317, de Roscoff souligne que
la continuité phylogénique des mécanismes de
défense en traitant de ceux des algues
pluricellulaires. On y trouve des mécanismes décrits
chez les plantes terrestres, avec reconnaissance de
l'agresseur,et induction des signaux déclenchant les
défenses
6
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Le coût pour les plantes de leurs mécanismes de
défense est une question ancienne,souvent évoquée,
mais rarement analysée en détail. JK Brown;p.339-
344, du John Innes Centre et M Heil;p.345-350,du
Max Planck Institüt de Jena, s'intéressent au coût des
résistances, énergétiques et écologiques, en partant
des plantes modèles pour traiter ces coûts dans les
plantes de grande culture. Les compromis réalisés, un
peu sans le savoir, commencent à peine à être révélés.
Dans le cas des plantes non cultivées le coût
écologique,comme une baisse de la pollinisation, ou
une baisse de l'adaptabilité, sont étudiés par M Heil.
Le rôle des substances volatiles émises par une
plante, après attaque par un herbivore et attirant les
ennemis de l'herbivore (insectes seulement quand
même,attirer le loup contre un mouton serait
amusant), est maintenant admis. Mais la perception du
signal par les plantes voisine l'est moins. IT Baldwin
et al.; p.351-354 font le tour des arguments en faveur
de cette dernière hypothèse. La conclusion est
relativement positive.
     
24. Le génome de Xylella fastidiosa avait été
séquencé par une équipe brésilienne, fierté
nationale (A Simpson.et al. Nature 406 (13JUL00)
151-157). Cette bactérie, pathogène du xylème,
attaque, depuis 1987, les agrumes en donnant une
sérieuse chlorose et une atrophie des fruits, mais
s'attaque également au caféier, à d'autres fruits,
notamment des pêches et la vigne, ainsi qu'à
l'amandier ou la noix de pécan.
Le groupe de Hazelkorn associé à Integrated
Genomics et Protometrix a séquencé et analysé trois
souches de Xylella fastidiosa pv citrus et analysé les
génomes partiels des pv almond et pv oleander.Ils ont
ensuite reconstitué les génomes, par informatique,
comblant ainsi les vides. Ils ont retrouvé les gènes de
conjugaison, par exemple, mais n'ont pas retrouvé de
système de"quorum sensing". Ils ont plus ou moins
caractérisé les gènes spécifiques à chaque pathovar.
A Bhattacharyya et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 99 (17SEP02) 12403-
12408.
     
26. On trouvera dans C Ritzenthaler et al.; Journal
of Virology 76, n°17 (SEP02) 8808-8819, une analyse
du développement d'un virus bipartite à ARN codant
de la vigne, le grapevine fanleaf nepovirus au niveau
des membranes cellulaires. Le virus non seulement
utilise les membranes du réticulum endoplasmique qui
sont déplacées dans la cellule, mais stimule la
production des phospholipides.Les protéines virales
de la réplication sont concentrées dans ce
compartiment artificiel, avec la traduction, tandis que
la protéine de capside et celle de mobilisation en sont
indépendantes.
On trouvera une discussion des différents systèmes
membranaires utilisés par des virus à ARN de ce type
dans des systèmes viraux végétaux et animaux comme
le poliovirus.
     
28. On trouvera dans D Baulcombe;Trends in
Microbiology 10 (JUL02) 306-308, une revue sur la
suppression du "silencing" par les virus. C'est le cas
de la protéine 2b du virus de la mosaïque du
concombre [HS Guo et al.; The EMBO Journal 21,
n°3 (01FEB02) 398-407].
La résistance aux virus est la fonction officielle du
"silencing", bien qu'on l'ait surtout étudiée du fait de
ses effets sur les transgènes. Elle est accompagnée par
l'émission d'un signal dit systémique qui comporte une
généralisation à toute la plante à partir du point
d'infection. Ce signal est probablement un ARN
mobile.
Or la protéine 2b est nucléaire et localisée dans les
cellules effectivement infectées et pourtant elle
empêche l'émission du signal. Elle n'a pas d'effet
après établissement du silencing.
Ceci doit exister également au moins chez les virus
d'insectes, car on a identifié un suppresseur de
silencing chez un nodavirus d'insectes (flock house
virus).H Li et al.; Science 296 (17MAY02) 1319-
1321.
Plusieurs points restent énigmatiques. Le plus
important est que le transport vers le noyau grâce à
un peptide signal (de n'importe quelle origine) est
indispensable. Or le signal d'alerte est disséminé via
les tubes criblés du phloème qui n'ont plus de noyau
(comme les hématies). On explique cette contradiction
en admettant que 2b intervient à deux niveaux dans le
mécanisme, seul l'un d'entre eux étant dépendant du
noyau.Mais l'auteur rappelle que le ciblage vers le
noyau partage des propriétés avec les translocations
intercellulaires.
     
Les Plantes recombinantes
29. Weyerhaeuser a obtenu l'US Patent n°6 395 204
(28MAY02) sur l'utilisation d'arbres recombinants
dont la lignine est moins pontée. Ceci facilite
nettement la plastification et le moulage du bois, et
donc la production d'objet relativement compliqués.
     
30. L'US Patent 6 452 068 (17SEP02), du groupe
de Chua, décrit l'utilisation de promoteurs
inductibles pour pouvoir utiliser un gène silencieux
de sélection ou de déclenchement de l'embryogenèse
somatique. Il s'agit du système utilisant les
œstrogènes ou les glucocorticoïdes. décrit dans J Zuo
et al.; Plant Journal 24 (OCT00) 265-273 et dans J
Zuo et al.; Current Opinion in Biotechnology 11
(APR00) 146-151.
     
7
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
31.Large Scale Biology Corp. (LSBC) a signé un
accord à long terme pour la production de lysozyme
chez les plantes pour le Growers Research Group qui
est un consortium californien de firmes impliquées
dans l'agriculture.
La Bioprocessing Division de LSBC à Owensboro,
KY, produira l'enzyme utilisable en dans des produits
vétérinaires et alimentaires. Industrial
BioProcessing 24 (AUG02).
     
Les Insectes et leur Maîtrise
32. L'ambiguïté des relations symbiotes/hôte chez
les insectes est entretenu par la découverte de
systèmes typiquement impliqués dans une invasion de
l'hôte par des bactéries pathogènes comme les
systèmes de sécrétion de type III. L'endosymbiote
secondaire,Sodalis glossinidius,de l'une des
mouches tsé-tsé exprime, par exemple, un tel système
avec les gènes caractéristiques inv/spa pour envahir
les cellules de leur hôte, la mouche tsé-tsé. Ce
système permet d'injecter dans la cellule-hôte une
série de protéines indispensables à l'envahissement
(voir le Bulletin de Septembre §39). On n'a encore
jamais pu démontrer quel bénéfice apporte à la
mouche cette bactérie intracellulaire.
Ses plus proches parents évolutifs se retrouvent
avec les symbiotes primaires des charançons
Sitophilus. Je rappelle que les symbiotes primaires
sont indispensables à leur hôte, ce qui n'est,
apparemment le cas pour les symbiotes secondaires.
Ils sont à transmission strictement verticale, et
associés à des tissus spécialisés. Dans ce cas on ne sait
pas cultiver la bactérie et elle n'a même pas de nom.
Un article de C Dale et al.; Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 99 (17SEP02)
12397-12402,analyse ce qui se passe pour ce parent
non encore enregistré par la systématique.La bactérie
de Sitophilus zeamaïs se multiplie dans l'embryon au
cours du développement et se localise dans un
bactériome (c'est donc un symbiote primaire) à la
périphérie de l'intestin antérieur de la larve.A la
métamorphose ce bactériome disparait avec les autres
tissus de la larve. Les bactéries migrent, alors, dans un
nouveau bactériome à la périphérie de l'intestin
postérieur. Or ce symbiote primaire (indispensable à
l'insecte) est également muni d'un système de
sécrétion de type III. Il y a donc là une étape
intermédiaire dans l'évolution d'un pathogène vers
un symbionte.
     
33.Eulophus pennicornis est une guêpe
ectoparasite de Lacanobia (alias Mamestra)
oleracea,la noctuelle potagère), qui doit se prémunir
contre la perte de ses œufs et de ses larves lors des
mues et doit donc neutraliser les réactions de
cicatrisation de la larve parasitée ainsi que ses
défenses immunitaires. Chez les insectes, les
hémocytes ont un rôle important dans l'obstruction
des ouvertures des téguments.Des sécrétions
protéiques de la guêpe perturbent très fortement la
survie, la mobilité, etc… de ces hémocytes.
Ce genre de conditionnements de l'hôte par des
guêpes endoparasites (pondant leurs œufs dans la
larve de l'hôte sont bien connus, et font intervenir
plusieurs facteurs injectés par la guêpe ou dégagés par
les larves à l'intérieur de la larve hôte.
Les mêmes attitudes sont observées avec les
ectoparasitoïdes où la femelle injecte avec ses œufs un
venin dont la composition est encore mal connue. On
vient de montrer que les larves de E. pennicornis
sécrètent des produits ayant également un effet
important sur les fonctions et la survie des
hémocytes. EH Richards et al.; Journal of Insect
Physiology 48 (SEP02) 845-855.
     
36.On sait que les symbiotes 
-protéobactériens
(Rickettsies) que sont les Wolbachia sont hérités
maternellement, et manipulent de nombreux aspects
de la vie des insectes (mais aussi d'autres arthropodes,
voir le Bulletin d'Août §48). Une étude utilisant le
marqueur que constitue le gène wsp qui semble
évoluer plus rapidement que le reste du génome et
communément utilisé pour analyser l'évolution,
montre que 13 des 46 espèces de mouches téphritides
(famille de la mouche méditerranéenne des fruits,
Ceratitis capitata) étudiées en Thaïlande ont été
infectées à plusieurs reprises par les Wolbachia par
des souches différentes. Elles en contiennent
plusieurs souches différentes et même des souches
encore inconnues actuellement et impossible à typer
par les séquences des gènes. L'originalité de l'étude
est d'avoir utilisé une PCR différentielle, plutôt que le
séquençage individuel du gène chez chaque souche
récoltée. W Jamnongluk et al.;Current Microbiology
45, n°4 (OCT02) 255-260.
Ces infections multiples sont stables, probablement
du fait des effets additifs. On a des difficultés à
préciser ces données,car on ne possède que peu de
marqueurs pour les distinguer.
     
8
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Les Biopesticides
37. L'US Patent n°6 399 060 (04JUN02) d'ABR
LLC à Honolulu couvre des métabolites fongiques de
Ganoderma,Lactiporus, Lentinus, Morchella (!!!) et
Pleurotus ayant une activité nématicide.
     
38. L'US Patent n°6 417 163 (09JUL02)
d'AgraQuest couvre l'utilisation d'une souche
particulière de Bacillus ayant un spectre de cibles
étendu avec insectes, champignons et bactéries
(beaucoup pour une seule bête).
     
39.On utilise commercialement, comme anti-
acridien en Australie, une formulation de
Metarhizium anisopliae mise au point par le CSIRO.
On l'utilise surtout dans des zones ou la présence de
grande surface d'eaux empêche d'utiliser des
insecticides chimiques. Comme le champignon
attaque également les cladocères (plankton crustacé)
on a vérifié que les conidies sont en quantités
suffisamment faibles pour ne pas attaquer cette faune.
C'est la firme Seed, Grain & Biotechnology qui
commercialise cette préparation. Industrial
BioProcessing 24 (AUG02).
     
40.La souche 2362 de Bacillus sphaericus (Bsph)
est un larvicide contre les moustiques. On en a
essayé de nombreuses formulations. Il possède, en
effet,une efficacité et une persistance appréciables, et
il est spécifique. Mais comme pour tous les
insecticides (bio- ou pas) des résistances sont
apparues, aussi bien en laboratoire qu'au champ chez
des moustiques du complexe Culex pipiens et, au
laboratoire, chez Culex quinquefasciatus. On a étudié,
chez ce dernier les stratégies possibles pour limiter
l'apparition des résistances. Des rotations avec
Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) permettent un
différé dans l'apparition de la résistance à B.sph. On
peut même obtenir une réversion d'une telle résistance
en sélectionnant sur Bti. Les auteurs montrent même
que des rotations Bti-Bsph accroissent la sensibilité à
Bti dans une lignée résistante à Bsph.NS Zahiri et
al.; Journal of Economical Entomology 95 (MAY02)
513-520.
     
41.Insect Biotechnology commercialise une
invention de l'University of Florida Medical
Entomology Laboratory et North Carolina State
University [US Patent n°6 413 530 (02JUL02)] qui
utilise deux pentapeptides. Il s'agit de fragments du
"trypsin modulating oostatic factor" (TMOF) contre
les moustiques en bloquant le métabolisme des acides
aminés nécessaires à la formation du vitellus. Il tue les
insectes en provoquant une satiété en protéines alors
que l'anti-nutritionnel déclenche une carence
mortelle. Le produit serait actif en deux jours (un
peu rapide pour un antinutritionnel) sur Aedes aegypti,
Culex quinquefasciatus, Anopheles albimanus et
Anopheles quadrimaculatus sous forme de levure
recombinante l'exprimant. Il peut également être
préparé sous forme de Chlorella recombinantes
(algue verte unicellulaire d'eau douce). Il serait
également actif sur d'autres insectes agronomiques
sous sa forme entière, mais pas sous forme des deux
pentapeptides. Industrial BioProcessing 24 (AUG02).
     
42. La prolifération de Pseudomonas syringae pv.
tomato,peut être limitée préventivement par
l'utilisation d'Azospirillum brasilense, une bactérie
dite "growth promoting". Il vaut mieux,effectivement
implanter A.brasilense avant l'attaque. Les deux
bactéries persistent longtemps (45 jours) dans le sol
après une inoculation séparée des semences.
L'inoculation simultanée élimine rapidement le
pathogène du sol.Sur les feuilles infectées, le
biopesticide a du mal à survivre. On peut améliorer
son efficacité en pulvérisant une solution d'acide
malique diluée tamponnée.Y Bashan et al.; Applied
& Environmental Microbiology 68 (JUN02) 2637-
2643.
     
44. Les Beauveria sont des champignons utilisés
commercialement comme entomopathogènes. On
vient de décrire une infection profonde humaine par
ce champignon chez un individu immunodéprimé.
MO Henke et al.; Journal of Clinical Microbiology 40
(JUL02) 2698-2702.
     
45. On espère utiliser des souches d'Enterobacter
cloacae contre Pythium ultimum sur concombre et
autres productions végétales.E.cloacae A145 est un
mutant de la souche 501R3 qui présente un défaut
marqué de persistance sur la plante, et qui est donc un
très mauvais biopesticide.Ce mutant a subi une
insertion d'un mini-transposon Tn5 dans le gène de la
ribose-5-phosphate isomérase, rpiA, qui assure
l'interconversion du ribose-5-phosphate et du
ribulose-5-phosphate et qui est donc l'enzyme clé de
la voie des pentose phosphates. La souche est bien,
de ce fait, ribose-auxotrophe. La voie des pentoses
phosphates semble importante, d'une façon ou d'une
autre, pour l'inhibition du développement de Pythium
dans la rhizosphère.SMLohrke et al.; Molecular
Plant-Microbe Interactions 15 (AUG02) 817-825.
     
9
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Les Productions animales
Les génomes
On trouvera dans F Mazet et al.; Current Opinion in
Genetics & Development 12 (AUG02) 393-396, une
analyse les théories sur les rôles de la duplication
génique et de la divergence de ces deux jeux de
gènes au cours de l'évolution primordiale des
Vertébrés. On trouvera une revue complémentaire
dans AL Hughes; Trends in Genetics 18 (SEP02) 433-
434 qui commentent en détail deux articles, l'un récent
et l'autre relativement ancien sur le sujet:J Zhang et
al.; Nature genetics 30 (APR02) 411-415 et
JJ Beintema;Molecular Biology and Evolution 7
(SEP90) 470-477).
Le rôle de la "néofonctionnalisation"
(l'exploitation d'un des deux gènes présents pour une
nouvelle fonction, après une suite de mutations au
hasard permise par la redondance, modèle de Ohno)
avant la perte sous forme de pseudogène est discuté.
Le problème réside dans le fait que la sélection ne
se préoccupe pas du potentiel évolutif d'un gène,
mais de ses avantages immédiats (ne pas perdre de
vue que la duplication a lieu dans un individu isolé
dans une population). La théorie voudrait donc que la
course néofonctionnalisation/pseudogène entraîne
l'élimination de la plupart des gènes dupliqués, ce que
l'observation infirme,beaucoup de gènes dupliqués
étant conservés (leur maintien a donc été sélectionné).
Une nouvelle théorie a donc été développée, celle
de duplication–dégénérescence– complémentation
(DDC),qui prend en compte non pas le gène
fonctionnel entier, mais les régions régulatrices du
gène et les domaines d'expression des produits dans
leur ensemble (avec leurs combinaisons potentielles).
La revue de Zhang et al. montrent avec des
arguments convaincants que les deux gènes des
ribonucléases pancréatiques, issus d'une duplication,
RNASE1 et RNASE1B du colobe (cercopithèque)
Pygathrix nemaeus,qui lui permettent de se fournir en
azote avec les ARNs de leurs bactéries intestinales (ce
sont quasiment des ruminants),résultent d'une
duplication il y a environ 4 millions d'années. On
constate alors une accélération des mutations non
synonymes (donnant des acides aminés différents)
dans RNASE1B,ce qui est la marque d'une sélection.
Neuf mutations ont ramené le point isoélectrique de
9,1 à 7,3. Le pH de l'intestin est de 6-7.
L'activité des deux enzymes a été comparée sur une
gamme de pH. RNASE1 a un pHopt de 8, RNASE1B
de 6.Huit des neuf mutations reproduites dans
RNASE1 suppriment l'activité contre les ARNs
doubles-brins caractéristique de cette enzyme chez les
mammifères. Il y a donc eu un compromis entre
l'abaissement du pHopt et de l'activité contre les
doubles-brins. On a une spécialisation des deux
enzymes.###
     
La transformation des cellules animales
49. On trouvera dans LMHoudebine; Journal of
Biotechnology 98 (25SEP02) 145-160 une revue sur
les techniques de production d'animaux
transgéniques et sur la régulation de l'expression
des transgènes. C'est surtout sur la production de
protéines hétérologues chez les gros mammifères
qu'est centrée la revue.
Elle commence par décrire les différentes
techniques de transgenèse, dont celles faisant appel à
une modification de cellules en culture suivie d'un
clonage.
Chez la plupart des gros mammifères,l'injection
d'ADN dans les pronucléi de l'œuf est la méthode la
plus répandue, mais avec des rendements plus faibles
que chez la souris. Chez les Vertébrés dits inférieurs
(où l'auteur place les oiseaux), on ne voit pas les
pronuclei à cause de la charge en vitellus,et il faut
injecter dans le cytoplasme en forçant sur les doses
d'ADN. Le rendement est variable pour des raisons
inexpliquées.
Si chez plusieurs poissons (dont les salmonidés)
l'affaire est aisée, il n'en est pas de même pour le
poisson modèle medaka (Oryzias latipes). Le poulet
est, également, difficile à transformer et les
transgènes injectés dans le cytoplasme ne s'intègrent
que rarement dans le génome de l'hôte. On a bien
essayé de faciliter l'intégration en causant des cassures
dans l'ADN génomique et en espérant profiter de la
réparation pour insérer le transgène. On est,
cependant, coincé entre des cassures trop rares et
inefficaces, et des cassures trop fréquentes
entraînant des lésions irréparables.
Les transposons sont ici tout indiqués. Ils doivent
être défectifs pour éviter une mobilité et donc une
mutagenèse incontrôlée. La transposase est, alors,
fournie indépendamment. Le transposon mariner de
la Drosophile marche, moyennant quelques
modifications, chez les insectes, mais aussi le
medaka et le poulet (et même la souris).Plusieurs
transposons d'insectes fonctionnent dans des insectes
autres que celui d'origine car ils n'ont,probablement,
pas besoin de facteurs de l'hôte pour fonctionner.
Le transfert par les spermatozoïdes (c'est à dire
utilisant une voie naturelle) a toujours été le rêve des
généticiens. Mais beaucoup de "faux" succès ont
tempéré leur enthousiasme.
L'utilisation de vecteurs rétroviraux, surtout
étudiés pour la thérapie génique, est efficace chez le
poulet pour lequel on a développé des vecteurs
infectant les cellules germinales primordiales. Elle
l'est nettement moins dans les embryons mammaliens.
L'utilisation des lentivirus parmi les rétrovirus semble
très prometteuse (voir le Bulletin d'Avril §57).
Depuis Dolly on sait que des transferts de noyaux
sont un moyen de cloner des génomes qui peuvent
être modifiés avant d'être transférés. Knock-out et
addition de gènes ont ainsi été réalisés.Les additions
de gènes ont été réalisées chez la chèvre et le porc.
10
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Un knock-out a été réalisé chez le porc (en vue de
xénogreffes) et le clonage réussi chez le lapin (voir le
Bulletin de Juillet §72). Tout ceci indique qu'on sort
progressivement du modèle unique de la souris.
La régulation de l'expression des transgènes est
un autre problème. On attribue usuellement les aléas
de l'expression à un effet de position de l'insertion
dans le génome. "Enhancers" et "silencers" voisins
sont accusés de tous les maux,et ceci d'autant plus
que ces derniers sont nettement plus efficaces que les
enhancers. Ces interactions peuvent être contrecarrées
par des "isolateurs". L'allongement de l'ADN
flanquant le gène à exprimer est une autre solution. Il
faut cependant ajouter ces ADNs d'environ 100 kb par
recombinaison,ce qui doit être réalisé dans un hôte
qui s'y prête comme la levure.
Un certain nombre de précautions doivent être
respectées dans les montages, comme d'introduire au
moins un intron avant un cDNA, éviter les îlots CpG,
surtout dans les promoteurs, etc…. (voir également le
§)
La suppression de l'expression d'un gène
autochtone peut être réalisée par recombinaison
homologue, mais pas sans mal. On peut le faire à un
moment adéquat en utilisant les recombinaisons site-
spécifiques commandées par un promoteur pilotable
ou exprimé transitoirement par un plasmide.Jackson
Laboratory ou Charles River Company fournissent des
souris où la recombinase Cre agissant sur les sites
LoxP est exprimée dans des tissus précis.
L'utilisation des antisens est plus récente, soit sous
forme d'action directe avec appariement empêchant la
traduction, soit en y associant une activité
ribozyme. Les résultats sont aléatoires avec les
antisens artificiels, car les cibles sont peu accessibles.
La combinaison d'une hélicase et d'une ribozyme
semble être efficace.
L'interférence ARN découverte chez les végétaux,
et rapidement observée chez Caenorhabditis
correspond à une dégradation des ARNs, à partir d'un
ARN double brin correspondant, reconnu comme
étranger. On a fini par décrire cette interférence dans
des cellules de mammifères, car ils étaient masqués
par une dégradation non spécifique des messagers.
Ceci devrait donner une technique simplifiée
d'inactivation fonctionnelle de gènes.
D'autres techniques d'inactivation ont été inventées
comme la production de protéines tronquées jouant
le rôle de leurres pour les ligands des protéines
fonctionnelles. Le problème est d'éviter les effets
secondaires.
La recherche de promoteurs spécifiques et
pilotables est importante. Il est impossible de breveter
tous les promoteurs, ce qui laisse une part de liberté
dans la recherche de promoteurs intéressants.
Beaucoup de ces promoteurs sont inductibles par des
produits chimiques dont des antibiotiques comme la
tétracycline. Il faut alors se méfier de l'expression
réduite de base liée à la présence du promoteur, même
en l'absence de l'inducteur. On peut alors utiliser un
"silencer" pour réduire cette expression.
Une discussion intéressante de la technique Cre-
LoxP de recombinaison site-spécifique et de ses
limitations et améliorations figurent dans la revue.
     
52. Des vecteurs basés sur des alfavirus (virus
transmis aux vertébrés par des insectes piqueurs) sont
décrits dans l'US Patent n°6 451 592 (17SEP02). Les
alfavirus permettent une forte expression. Les
vecteurs sont basés sur les alfavirus de l'encéphalite
équine vénézuélienne,les virus Sindbis, de la Semliki
Forest, Ockelbo, et de la Ross River, pour couvrir les
trois groupes d'alfavirus.Ils ont été construits pour
limiter le plus possible la mort de la cellule infectée,
grâce à des mutations dans une zone précisée (et en
dehors, on ne sait jamais…). Les séquences sont
exprimées à partir d'un cDNA avec un promoteur
phagique (SP6,T3 ou T7) pour permettre la
transcription en ARNs. Un réplicon du virus
permettant la production des quatre protéine non-
structurales est présent.
     
53.La régulation de l'expression de protéines
hétérologues grâce aux vecteurs alfaviraux est
décrite dans l'US Patent n°6 451 579 (17SEP02)
d'Invitrogen. Il s'agit de piloter la réplication par
introduction de protéines régulatrices. On l'inhibe
par la protéine MxA, ou on la stimule par introduction
des protéines de réplication. Le brevet couvre
également la technique d'introduction des protéines
avec des lipides cationiques ou par fusion avec des
protéines capables de transporter d'autres à travers les
membranes avec, notamment l'inévitable (et
contestée) protéine VP22 et la protéine Tat. Les
promoteurs chargés de l'expression comprennent un
promoteur stimulable par la muristérone.
     
54. Les picornavirus (famille du poliovirus et de la
fièvre aphteuse) présentent bien des caractéristiques
intéressantes de vecteurs d'immunisation.
Malheureusement ces virus sont, en général,
génétiquement instables ce qui empêche de les
utiliser. Des chercheurs de Duke University ont
remplacé des séquences régulatrices non codantes en
introduisant des sites d'entrée de ribosomes (IRES)
en amont de séquences codantes de protéines
hétérologues.On sait que ces éléments permettent la
traduction de deux gènes quand ils sont interposés
entre eux. AT Dufresne et al.; Journal of Virology 76,
n°17 (SEP02) 8966-8972.
     
55. Un brevet d'origine coréenne, de Viromed, est
traduit en US Patent 6 451 595 (17SEP02), et décrit
un vecteur rétroviral à haute efficacité et sûreté
basés sur le rétrovirus MLV (Murine Leukemia
Virus). Les séquences correspondant au gène pol de la
polymérase du virus est complètement délété pour
éviter une recombinaison homologue entre
molécules,qui est un défaut considéré comme gênant
des vecteurs rétroviraux. Un intron hétérologue,
et/ou un accepteur d'épissage peuvent être inséré en
amont du site d'insertion du transgène pour faciliter
l'expression. L'expression est renforcée par l'insertion
un promoteur fort, une séquence U3 complète ou une
LTR 5' (Long Terminal Repeat possédant des
séquences promotrices). On peut placer, en aval du
site d'insertion, un site d'entrée des ribosomes (IRES)
ou un promoteur minimal de SV40 pour exprimer un
second gène.
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11
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Les clonages
56. Le clonage par transfert nucléaire chez le
poisson zèbre (Danio rerio) après culture de longue
durée des cellules donneuses décrit dans K Lee et al.;
Nature Biotechnology 20 (AUG02) 785-786 après
celui du medaka décrit, au début de l'année dernière,
par Y Wakamatsu et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 98 (30JAN01) 1071-1076,
est un pas en avant dans l'analyse des génomes de
poissons et de leur exploitation.
On avait déjà cloné des poissons plusieurs fois
depuis les années 60s, mais sans obtenir des individus
diploïdes fertiles.
Les cellules donneuses dans la plus récente
publication, sont des fibroblastes d'embryons de 5 à
15 somites. Ils ont été cultivés pendant au moins 12
semaines. Ils ont été transformés en culture par un
vecteur rétroviral et permettant l'expression d'une
protéine fluorescente verte classique.
Le ciblage de l'inactivation de gènes devient donc
possible.On sélectionnera les inactivations en culture
puis on introduira un noyau sélectionné dans un
ovocyte énucléé.
On dispose de cellules ES-like (Embryonic
Somatic) qui sont cultivées sur une couche nourricière
de cellules de truite pour éviter leur différenciation.
On n'a pas encore essayé la recombinaison
homologue chez ces cellules. Des expériences de
transformation avec des plasmides linéaires indique
que cette recombinaison est possible, même si c'est
avec une faible fréquence. On doit actuellement se
bousculer dans ce domaine.RD Murphey et al.;
Nature Biotechnology 20 (AUG02) 785-786.
Par ailleurs la première analyse de poissons par
génétique inverse sont décrits dans E Wienholds et
al.; Science 297 (05JUL02) 99-102. Je rappelle que
l'on part de la séquence et on recherche un phénotype.
Les auteurs ont mutagénisé des poissons zèbres avec
de l'éthyl-nitrosourée. Les auteurs ont, alors,analysé
les mutations dans certains exons du gène rag1. C'est
une technique dénommée TILLING
(Targeting-Induced Local Lesions IN Genomes).
L'utilisation du séquençage permet de détecter les
mutations, mais on possède maintenant des techniques
beaucoup plus simples. Une enzyme de restriction
particulière,l'enzyme de réparation des mauvais
appariements du céleri (CEL I) qui est une
endonucléase coupant un brin d'ADN dès qu'elle
rencontre une absence locale d'appariement d'une
seule paire de base.
La fréquence de succès de la transformation par
transfert nucléaire est faible, comme ailleurs, chez
Danio rerio (2%),mais le nombre d'œuf est quasi-
illimité. L'utilisation de la technique trouvera
probablement sa place dans recherche de fonction par
inactivation. Elle complètera la technique
d'inactivation embryonnaire transitoire par
morpholinos qui ne peuvent pas être utilisés au cours
des stades tardifs du développement et encore moins
chez l'adulte.
     
Le développement
57. On trouvera dans DJ Prockop; Nature Biotechnology 20 (AUG02) 791-792,un commentaire supplémentaire
du §62 du Bulletin d'Août sur les cellules souches "adultes".
     
La Physiologie
58. On trouvera dans L East et al.; Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) –General Subjects 1572
(19SEP02) 364– 386, une revue sur la famille des
récepteurs du mannose.Elle est constituée du
récepteur du mannose proprement dit, le récepteur dit
"M-type"des phospholipases sécrétoires A2
(PLA2R), DEC-205/gp200-MR6 et
Endo180/uPARAP.Toutes sont des glycoprotéines
ayant la même structure avec un domaine N-
terminal riche en cystéines, un domaine de type
fibronectine type II (FNII)et 8 à 10 domaines C-
terminaux de type lectine type C (CTLDs) qui font
leur originalité, même si ces domaines ont perdu leur
activité de type C. Ils ont évolué en utilisant
différents domaines pour interagir avec des ligands
différents. Ils interviennent donc dans des formes
différentes d'endocytose et de phagocytose.
Seul MR et Endo180 fixent les monosaccharides.
CTLD5 au sein de PLA2R n'est plus une lectine
fonctionnelle et a basculé vers une interaction
protéine/protéine. Le domaine N-terminal de MR
fixe les sucres sulfatés. La séquence des domaines
FNII de toute la famille indique qu'ils fixent les
collagènes. Les courts domaines cytoplasmiques de
ces récepteurs sont responsable du ciblage vers la
machinerie endocytotique.
On a une idée des fonctions assurées. Ainsi MR
joue un rôle dans l'immunité innée et adaptative,
DEC-205 est impliqué dans l'internalisation
d'antigènes pour la présentation aux cellules T, et
Endo180 doit certainement participer au remodelage
de la matrice extracellulaire.
     
Le système immunitaire
59.RM Zinkernagel fait remarquer dans Current
Opinion in Immunology 14 (AUG02) 523–536 que le
rôle de la mémoire immunitaire est ambiguë tel
qu'il est présenté dans les textes sacrés de
l'immunologie.Il est, en effet, classiquement invoqué
que la mémoire immunitaire est indépendante de
l'antigène, même si l'antigène est nécessaire à sa
spécificité.
On insiste beaucoup moins sur le fait que la
protection grâce à cette mémoire est antigène-
dépendante.
12
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
La mémoire immunitaire repose sur une population
clonale persistante de cellules antigène-spécifiques
qui permettrait une réponse secondaire rapide.
Le rôle protecteur est celui qui est encore l'objet
de discussions. Ceci tient au fait que l'immunité
innée est probablement responsable à plus de 90%
des défenses de l'organisme. L'absence de récepteurs
des interférons  entraîne, par exemple, une
sensibilité particulière aux infections virales, même si
les mutants sont, par ailleurs,parfaitement
immunocompétents.
Zinkernagel va jusqu'à oser la question de savoir
pourquoi les vertébrés ont besoin d'une mémoire
immunitaire. Au fond si une réponse primaire jointe
au reste de l'immunité innée a suffi lors d'une
infection primaire, pourquoi inventer la mémoire? Si
la résistance primaire a été insuffisante, la mémoire ne
sert à rien.
     
60. Les récepteurs Toll-like (TLRs) de l'immunité
innée détectent les microorganismes et assurent une
protection de l'organisme contre les infections. Leur
signal est transduit par MyD88 et la sérine/thréonine
kinase IRAK. Cette kinase comporte deux kinases
actives,IRAK et IRAK-4, et deux inactives,IRAK-2
et IRAK-M. L'expression d'IRAK-M est limitée aux
monocytes/macrophages, alors que celle des autres
IRAKs est ubiquitaire. On vient de montrer que
l'expression d'IRAK-M est bien induite par les TLRs
mais qu'elle joue un rôle de répresseur du signal.
IRAK-Mempêche la dissociation d'IRAK et IRAK-4
de MyD88 et la formation des complexes IRAK-
TRAF6 (voir le Bulletin d'Avril §75).K Kobayashi et
al.; Cell 110 (23JUL02) 191-202. Un commentaire
intéressant est publié dans TWMak et al.; Nature 418
(22AUG02) 835- 836. ###
     
62. L'activation des cellules T est un des éléments
essentiels de la réponse immunitaire via ce type de
cellules. Le complexe récepteur (TCR-CD3) est
composé des sous unités TCR

liant les peptides
antigéniques présentés par le complexe MHC. Il est
associé au complexe CD3 qui est chargé de la
transmission du signal. On a récemment montré que
cette activation est réalisée par un changement de
conformation de CD3
après fixation du ligand sur
le récepteur qui expose une séquence riche en
prolines.Ce changement de conformation facilite la
fixation de la protéine adaptatrice Nck. D Gil et al.;
Cell 109 (28JUN02) 901-912.Ce changement de
conformation à lieu avant et indépendamment de
l'activation de la tyrosine kinase classique liée au
récepteur. Les auteurs montrent, en outre, que si on
interfère avec l'association Nck/CD on empêche la
maturation de la synapse immunitaire (voir le Bulletin
d'Août §75) et l'activation des cellules T.
     
63. Les cellules dendritiques (DCs) sont capables
de discriminer les classes de microorganismes, de
présenter les antigènes partiels, associés aux MHC I et
II, aux cellules T, et d'amorcer les réponses
immunitaires innées et adaptatives. Les DCs savent
intégrer des stimuli issus des pathogènes et d'autres
cellules qu'elles amènent à converger vers le site
d'infection et sont, en quelque sorte, les chefs
d'orchestre du concert immunologique.M Rescigno;
Trends in Microbiology 10 (SEP02) 425-431.###
     
Les Vaccins
64.L'inoculation de grosses molécules d'ADNs
circulaires produites dans des bactéries
recombinantes posent des problèmes pour les
vaccinations du fait de leur taille, des impuretés liées
à leur hôte de multiplication et,notamment,la
présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Les
ADNs linéaires obtenus par PCR,stabilisés par une
modification par des phosphorothioates et ciblées vers
le noyau par un peptide de ciblage nucléaire ont une
meilleure efficacité.Le principe a été utilisé, avec
succès, pour une immunisation contre le Hantavirus
Puumala.P Johansson et al.; Vaccine 20 (10SEP02)
3379-3388.La question que je me pose est celle du
prix de revient.
     
65. La vaccination par des ADNs est souvent
moins efficace chez les gros animaux que chez la
souris. L'utilisation de l'électroporation améliore les
choses.Ceci a été réalisé chez le porc avec des
plasmides d'immunisation conter deux antigènes
différents, la glycoprotéine D de l'herpès virus bovin
et l'antigène de surface de l'hépatite B.
L'électroporation a été réalisée avec, soit une électrode
unique, soit une électrode à six aiguilles.
L'amélioration de l'efficacité est nettement améliorée
et peut être réalisée simultanément avec les deux
plasmides sans interférence. On peut combiner cette
technique avec n rappel protéique. S Babiuk et al.;
Vaccine 20 (10SEP02) 3399-3408.
L'efficacité de l'immunisation contre
Mycobacterium tuberculosis par injection
intramusculaire d'ADN gagnerait à être améliorée.
Elle peut, effectivement l'être si on la combine avec
une électroporation.S Tollefsen et al.;Vaccine 20
(20SEP02) 3370-3378.
     
66. On est, quand même, à la recherche d'adjuvants
acceptables autres que les sels d'aluminium. Un
nouvel adjuvant constitué de microparticules (2-3m
de diamètre) très poreuses de polyacryl-amidon dans
une émulsion eau dans huile,stabilisée par des
chaînes d'hydrocarbures est décrit dans L Wikingsson
et al.; Vaccine 20 (20SEP02) 3355-3363.
     
13
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Les Pathogènes
68.Bacillus anthracis, l'agent du charbon utilise
une stratégie particulière d'envahissement des alvéoles
pulmonaires. Il survit dans les macrophages
alvéolaires (macrophages libres dans la lumière de
l'alvéole) après germination de la spore au sein du
phagolysosome. Il émerge ensuite dans le milieu, où
il prolifère. Cette germination protégée joue un rôle
essentiel dans la forme pulmonaire souvent fatale de
la maladie. Le facteur œdémateux (EF, une adénylate
cyclase) et le facteur létal (LF) associé chacun avec
l'antigène protecteur (PA) , les deux armes principales
de ce Bacillus tuent le patient, certes, mais assurent
surtout sa survie dans les macrophages. On trouvera
dans C.Guidi-Rontani; Trends in Microbiology 10
(SEP02) 405-409, une revue sur la pathogenèse du
bacille du charbon.###
     
70. La leucotoxine (Lkt) sécrétée par Mannheimia
(alias Pasteurella) haemolytica est une toxine dite
RTX spécifique des leucocytes des ruminants. Elle
se lie aux intégrines ß2 de surface. Ces intégrines ont
en commun une sous-unité, CD18,qui s'associe à
trois chaînes 
distinctes, CD11a, CD11b et CD11,
constituant trois intégrines ß2 différentes :
CD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (Mac-1) et
CD11c/CD18 (CR4). Lkt se lie à ces trois intégrines
bovines,ce qui est la cause de la cytolyse des
leucocytes.MS Deshpande et al.; Infection and
Immunity 70 (SEP02) 5058-5064.
     
72. On continue à se préoccuper de la prochaine
pandémie de grippe en Asie.MHatta et al.; Trends
in Microbiology 10 (JUL02) 340-344. On a montré
que la virulence de la souche H5N1 (H pour
hémagglutinine et N pour neuraminidase) de 1997 à
Hong Kong qui a entraîné la mort de six personnes sur
les 18 infectées était liée à une seule substitution de
l'acide aminé 627 dans la protéine PB2 du virus
(l'une des trois sous-unités de l'ARN-polymérase).
Je rappelle que seuls trois types de souches ont été
repérés,jusqu'à présent, chez l'homme (H1N1, H2N2
et H3N2).En 1999 c'était une souche H9N2 qu'on a
repérée chez deux enfants à Hong Kong. Ils
possédaient les mêmes gènes de protéines internes que
la souche H5N1. Le virus aviaire H5N1 est, depuis,
réapparu sur les marchés de volailles de la ville en
Mai 2001, mais aucune infection humaine n'a été
recensée. Cette persistance de souches ayant déjà
prouvé leur virulence montre bien qu'une menace de
pandémie d'origine aviaire est présente.
Bien que le porc soit considéré comme un
intermédiaire privilégié (du fait de ses récepteurs du
virus) entre volaille et homme, l'épidémie de 1997
montre clairement qu'un passage direct des oiseaux à
l'homme est possible.
En réalité, parmi les virus isolés des malades de
1997 on a détecté des types à haute [A/Hong
Kong/483/97 (HK483)] et faible [A/Hong
Kong/486/97 (HK486)] pathogénicité pour la souris.
La pathogénicité pour la souris liée à la substitution
dans PB2,est complétée par la nécessité de disposer
du site de clivage de HA caractéristiques des souches
virulentes chez le poulet. Une délétion dans ce site
convertit, chez la souris, la souche HK483 en souche
avirulente comme chez le poulet.###
     
73. Les résistances et sensibilités à divers virus ont
une cause génétique qui est, parfois, difficile à établir.
Deux publications viennent d'aborder le problème à
propos du virus West Nile.AA Perelygin et al.;
Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 99 (09JUL02) 9322–9327 et T Mashimo et al.;
Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 99 (20AUG02) 11311–11316.
Les deux équipes montrent qu'une mutation dans
un gène connu des défenses est impliquée dans une
résistance unigénique. Une mutation dans l'un des
gènes de la 2',5'-oligoadénylate synthétase (une
transition C-à-T dans le quatrième exon de Oas1b-
L1), est associée à la sensibilité au virus chez la
souris. La mutation transforme une arginine des
souches résistantes en UGA (stop) des souches
sensibles. Cette enzyme fait partie de la centaine de
protéines dont l'expression est régulée par
l'interféron. Elle intervient dans la destruction par la
RNase L des ARNs détectés sous forme de doubles
brins. La RNase L est une endoribonucléase latente
activée après liaison avec les ppp(A2p)nA
oligoadénylates synthétisés par la 2',5'-oligoadénylate
synthétase. La sélectivité envers certains virus est
étonnante. ###
     
74. Les virus Ebola et de Marburg sont des virus à
ARN de polarité négative (non codant). Le génome de
19kb du virus Ebola porte sept gènes codant huit
protéines. Chaque gène est flanqué de séquences
régulatrices non transcrites de début et de fin de
transcription. Le complexe de transcription balaye
l'ARN viral pour y trouver ces signaux.
La protéine VP30 de la nucléocapside du virus
Ebola est également un activateur de transcription.
Cette stimulation dépend d'une boucle au début du
premier gène. La destruction de cette boucle ne laisse
plus qu'une transcription indépendante de VP30. Mais
la transcription du premier gène est nécessaire à celle
du second qui est VP30-indépendante. Quand on
permute les séquences de début de transcription des
deux gènes,la transcription du deuxième devient
VP30 dépendante.MWeik et al.; Journal of Virology
76, n°17 (SEP02) 8532-8539.
     
75. Les réponses immunitaires de souris et de singes
Cynomolgus au virus Ebola sont stimulées par du
virus irradié encapsulé dans des liposomes. La
réponse immunitaire fait appel aux cellules CD4
+
(ceux produisant l'interféron ). Malheureusement la
mort n'est que différée chez les singes. MRao et al.;
Journal of Virology 76, n°18 (SEP02) 9176-9185.
     
14
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Les Productions Microbiennes
76. Chez E.coli, les chimiorécepteurs à deux
composants associent l'histidine kinase CheA et le
régulateur de réponse cytoplasmique CheY. La
présence du ligand module l'activité de la kinase et
donc la proportion de CheY et CheB phosphorylées
par cette kinase. A la disparition du stimulus,CheR,
une méthyltransférase, méthyle des glutamates du
domaine cytoplasmique des chimiorécepteurs.
Phospho-CheB est une méthylestérase qui permet de
moduler cette activité. C'est pourquoi on a appelé
MCPs (Methyl-accepting Chemotaxis Proteins) ces
systèmes récepteurs. L'auto-association de ces
protéines, grâce à leurs domaines cytoplasmiques en
dimères, puis en trimères de dimères (parfois en
ensembles plus importants à l'échelle du m) est un
des éléments fonctionnels importants de la réception.
On peut manipuler l'association avec des ligands
multivalents et ainsi prouver que le rassemblement
des récepteurs est effectivement fonctionnel chez des
bactéries aussi différentes dans ce domaine que
Bacillus subtilis,Spirochaete aurantia et Vibrio
furnissii,et que ceci contribue à l'amplification du
signal.AC Lamanna et al.; Journal of Bacteriology
184, n°18 (SEP02) 4981-4987.###
     
77. Les éléments mobiles de la classe IncJ ont pour
prototype l'élément R391. Ils sont un peu bizarres.
R391 est un élément conjugatif (transmissible) et
intégratif (s'insérant dans le chromosome bactérien)
complexe. R391 comporte un grand nombre de
groupes de gènes d'origine apparemment différentes,
dont un élément mobile emboîté,mais,curieusement,
ne code aucune protéine de réplication identifiable
(mais 30 des 96 gènes n'ont pu être caractérisées).De
ce fait, ce n'est donc pas un "plasmide" authentique,
car il ne peut se répliquer de façon autonome, et doit
utiliser les enzymes de réplication de la bactérie
hôte. Cela est probablement vrai des autres plasmides
du groupe d'incompatibilité IncJ. D Bölter et al.;
Journal of Bacteriology 184, n°18 (SEP02) 5158-
5169.###
     
78. La régulation temporelle du bourgeonnement
chez Saccharomyces cerevisiae(une fois par cycle
cellulaire) et spatiale (le bourgeonnement se fait en
un site particulier de la cellule mère) est encore
largement inconnue, bien que décrite
morphologiquement en détail.
On vient d'identifier des mutants produisant de
multiples bourgeons dans des sites aléatoires au
cours d'un seul cycle cellulaire. Ce sont des mutants
de la petite GTPase Cdc42p. La mutation critique
affecte l'acide aminé 60 du domaine permettant la
fixation du GTP et son hydrolyse. Elle autorise la
cellule à se passer du facteur d'échange de guanine-
nucléotide Cdc24p, entraînant une hyperactivité de
Cdc42p. Cdc24p est donc uniquement chargée
d'activer Cdc42p qui détermine la fréquence du
bourgeonnement.JP Caviston et al.; Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 99 (17SEP02)
12185-12190.
     
79. L'activité enzymatique mitochondriale et la
capacité respiratoire de Saccharomyces cerevisiae
décroît à la fin de la période exponentielle de la
croissance de la population. Il y a donc modulation
des fonctions mitochondriales qui contribue à la
régulation à long terme de la phosphorylation
oxydative. Plusieurs observations indiquent que la
voie Ras/cAMP/PKA intervient (PKA pour Protein
Kinase A) en fin de phase exponentielle.Des
chercheurs de Bordeaux viennent de montrer qu'une
stimulation de la voie cAMP/PKA entraîne un
découplage entre synthèse de biomasse et
catabolisme cellulaire. Ils ont utilisé la manipulation
du cAMP.L Dejean et al.; Biochimica et Biophysica
Acta (BBA) – Bioenergetics 1554 (01JUL02) 159-
169.###
     
80. Daqing est le plus grand champ pétrolier
exploité en Chine. Sa profondeur est en moyenne de
400 m avec une épaisseur moyenne de 9 m et une
porosité moyenne de 16%. Sa température est
relativement modérée avec 45°. Les fractions lourdes
du pétrole représentent environ 20% du brut. Il est
l'objet des attentions du State Key Laboratory of
Microbial Technology, de l'Université de Shandong,
ainsi que de l'Institut Technique du Pétrole régional
(Daqing Petroleum Institute). Des chercheurs ont
utilisé la souche P-1 de Pseudomonas aeruginosa et
ses produits métaboliques (essentiellement des
surfactants) pour stimuler de 11% l'extraction du
pétrole en diminuant la pression d'injection de
38%. C'est une technique classique de MEOR
(Microbial Enhanced Oil Recovery, mais qui n'est
encore que peu utilisée, sauf à titre expérimental
(selon mes renseignements). Dans ce cas, la
modération de la température et de la pression sont
des facteurs favorables. Q Li et al.; Biochemical
Engineering Journal 11 (SEP02) 197-199.
     
81. Le sorbitol (alias D-glucitol) est un agent
texturant et humectant ainsi qu'un édulcorant et il
est utilisé parallèlement à l'isomaltitol, au xylitol et au
mannitol.Leur pouvoir sucrant est égal, voire un peu
inférieur à celui du saccharose. Ces polyalcools sont
surtout utilisés comme agents de texture, et on les
trouve dans les chewing gums par exemple.Le
marché mondial du sorbitol était de plus de 500 000
tonnes par an.
Il est produit chimiquement, mais Zymomonas
mobilis est capable de produire du sorbitol à partir du
fructose.Ceci est réalisé en une seule étape grâce à
une glucose-fructose oxydoréductase périplasmique
uniquement connue chez cette bactérie.
Une revue décrit comment on pourrait exploiter
cette particularité.MMSilveira et al.; Applied
Microbiology & Biotechnology 59, n°4-5 (AUG02)
400-408. Elle traite au passage de la production
chimique et des utilisations, mais surtout de la
production par Zymomonas mobilis. ###
     
15
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
84. Les polyhydroxyalcanoates (PHAs) sont des
réserves carbonées stockées en déficit d'azote, en
particulier. Ils s'accumulent intra-cellulairement. Leur
utilisation comme bioplastiques imitant (en
biodégradable) le polyéthylène est handicapée par leur
prix de revient encore excessif. Il faut améliorer
toutes les étapes de production, de récupération et de
traitement de ce point de vue. Une des techniques qui
pourrait être utiles est l'autolyse de la cellule
productrice à la fin de la phase d'accumulation. C'est
un procédé de ce type que des chercheurs de Tokyo et
de Beijing décrivent dans AK Hori et al.; Applied
Microbiology & Biotechnology 59, n°2-3 (JUL02)
211-216.Ils utilisent une souche de Bacillus
megaterium qui s'autolyse quand son substrat est
épuisé. ###
La mutagenèse au hasard du gène de la
polyhydroxyalcanoate (PHA) synthase d'Aeromonas
punctata dans la souche mutator Escherichia coli
XL1-Red a permis au groupe de Rehm, à Münster, de
récolter 200 000 mutants.
D'une façon générale,il n'y a pas de corrélation
stricte entre l'activité enzymatique et l'accumulation
de PHAs. Mais on constate, qu'en règle générale,ces
mutants possèdent une longueur des acides gras
corrélée positivement avec l'activité enzymatique.
L'enzyme d'A.punctata préfère les 3-hydroxybutyryl-
CoA et le 3-hydroxyhexanoyl-CoA. Les fractions
molaires de 3-hydroxybutyrate et 3-hydroxyhexanoate
restent constantes chez les divers mutants étudiés.
AA Amara et al.; Applied Microbiology &
Biotechnology 59, n°4-5 (AUG02) 477-482. ###
Des chercheurs de l'Institut sur l'environnement de
Leipzig-Halle, ont réussi à faire produire des
polyhydroxybutyrates en utilisant en continu des
composés aromatiques toxiques comme substrat. Ils
ont utilisé Comamonas acidovorans,C.testosteroni,
Ralstonia eutropha et Variovorax paradoxus JMP
116. Le bon déroulement du processus est suivi par le
dégagement de chaleur. L'US Patent 6 395 520
(28MAY02) couvre ce procédé.
     
86. La quête de la production d'éthanol à partir de la
biomasse lignocellulosique continue. La principale
source en est, dans nos pays, les bois tendres
(softwood, pins et épicéas par exemple).
Une revue sur l'état de l'art dans l'utilisation de la
cellulose et des hémicelluloses est parue avec
MGalbe et al.; Applied Microbiology &
Biotechnology 59,n°4-5 (AUG02) 618-628. On y
trouvera également une analyse des procédés ainsi que
de leur économie.
Il faut partir d'un substrat le moins cher possible.
Des copeaux de pin ou épicéa contiennent 43-45% de
cellulose, 20-23% d'hémicelluloses et 28% de lignine.
Le sucre principal des hémicelluloses est le mannose
que S.cerevisiae sait fermenter. On peut
théoriquement produire, à partir d'une tonne de ces
copeaux,410 litres de bioéthanol en utilisant les
seuls hexoses, et 455 litres si on peut fermenter tous
les sucres (les pentoses représentent 6-7% des sucres
présents).
Mais la fermentation de ces sucres suppose une
hydrolyse des polymères avec un rendement
suffisant, ce qui se révèle beaucoup plus difficile. Le
prix du substrat brut est très faible, mais sa
préparation en substrat fermentescible est
actuellement beaucoup trop coûteuse pour qu'un
industriel veuille bien se pencher sur le problème.On
peut assurer cette hydrolyse par des acides dilués ou
concentrés ou par voie enzymatique.
L'hydrolyse enzymatique est donc recherchée.
D'où les programmes américains sur l'abaissement du
coût des enzymes (cellulases et autres commentés
dans plusieurs des Bulletins (voir, par exemple, le
Bulletin de Décembre 2001 §140).
Ceci n'empêche pas d'avoir à éliminer les produits
non fermentescibles, dont la lignine. Celle-ci est
particulièrement abondante dans les bois tendres et la
proportion acétylée est inférieure à celle des bois
durs. De ce fait, l'autohydrolyse est très restreinte.
La méthode la plus pratiquée de dissociation du bois
est le traitement à la vapeur avec ou sans acide (le
plus souvent H2SO4 qui cause des corrosions,ou SO2
qui est malheureusement très toxique). Un
prétraitement alcalin est relativement efficace sur
des substrats herbacés ou des déchets agricoles, mais
pas sur bois.
Un des problèmes engendrés par ces techniques est
que la lignine ne peut plus être utilisée comme
biocombustible.
Une difficulté supplémentaire est que pour obtenir
le maximum de sucres de l'hémicellulose et de la
cellulose des prétraitements différents sont
nécessaires. On essaye donc de procéder en deux
étapes, mais le résultat doit encore être évalué.
L'étape d'hydrolyse proprement dite fait intervenir
des enzymes comme les cellulases. Les plus efficaces
sont fongiques. Les cellulases doivent être complétées
par une cellobiase (-glucosidase), car le cellobiose
donne lieu à une forte inhibition par le produit.
L'établissement des conditions optimales d'hydrolyse
sont difficiles à déterminer car elles dépendent du
substrat, de l'origine de l'enzyme, de la durée de
l'hydrolyse qui influe sur la température optimale,et
tout ceci perturbe les calculs économiques.
L'hydrolyse peut être pratiquée en même temps
que la fermentation (SSF pour Simultaneous
Saccharification and Fermentation) ou séparément
(SHF pour Separate Hydrolysis and Fermentation).
Cette dernière permet d'optimiser les deux phases
pour les températures, mais laisse les sucres
rétroinhiber les enzymes (cellobiose pour les
cellulases et glucose pour la -glucosidase) alors que
la SSF soustrait les sucres au fur et à mesure de leur
libération. La SSF présente une difficulté liée la
difficulté à recycler la levure qui est mélangée aux
résidus de lignine.
C'est Saccharomyces cerevisiae qui est l'organisme
le plus utilisé pour la fermentation, mais Zymomonas
(voir le §81) donne une plus forte concentration en
bioéthanol, mais elle est plus fragile. La fermentation
des pentoses est difficile à associer à celle du glucose.
On a donc modifié génétiquement S. cerevisiae,Z.
mobilis et Escherichia coli pour permettre cette
utilisation.
16
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Le montage d'une Saccharomyces cerevisiae
fermentant le xylose à partir d'une souche industrielle
bonne productrice d'éthanol est décrit dans J Zaldivar
et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 59,n°4-
5 (AUG02)436-4422.
Pour l'instant, on en reste au stade du laboratoire.
De toute façon le xylose est beaucoup moins abondant
que le mannose (par exemple) dans les bois tendres et
ne mérite pas, dans ce cas, un investissement
substantiel. On pourrait par contre les utiliser pour
produire sur place les enzymes indispensables avec
un autre organisme utilisant le xylose. Il faut
cependant, noter que ce sucre se retrouve dans les
effluents du "craquage" du bois, mais accompagné par
de nombreux inhibiteurs, volatils certes, mais présents
qui peuvent handicaper l'utilisation d'un Trichoderma,
par exemple.
L'économie de ces procédés dépend beaucoup des
coûts de l'énergie. On utilise souvent la lignine
comme carburant,mais c'est aussi un sous-produit
tout à fait vendable. Il faut donc réduire au maximum
les dépenses d'énergie. Plusieurs économies possibles
sont discutées dans la revue.
Le prix de revient calculé d'un litre d'éthanol
produit par ces procédés est évidemment très
approximatif. Il va de 0,32 à 1 dollar/litre. Le
matériel de départ contribue à raison de 25 à 40%,
et varie selon les pays, la SSF 25% (dont la moitié
pour les enzymes), la distillation et le séchage des
solides 30% (l'éthanol étant en général très dilué avec
2% environ).
Ceci explique qu'aucune installation d'hydrolyse
enzymatique en vraie grandeur n'était disponible pour
les bois tendres jusqu'à présent. Récemment,
cependant, la firme canadienne Iogen a construit une
installation de démonstration commerciale pour la
conversion de déchets agricoles. ###
     
88. L'acide hyaluronique est une répétition du
dimère de N-acétyl-glucosamine et d'acide
D-glucuronique extrait jusqu'à présent des crêtes de
coq, et utilisé en cosmétique. Novozymes a acquis la
licence de production de hyaluronate de Hyalose
(RE37 336 (21AUG01) qui est une reprise de l'US
Patent n°5 015 577 (14MAY91) de l'Université of
Texas at Austin, cédée à Hyalose et qui couvrait la
séquence de l'hyaluronate synthase d'un
Streptococcus.Un accord de développement avait été
signé avec Hyalose au même moment, Emergent
Technologies gérant l'affaire.Industrial
BioProcessing 24 (SEP02). Un brevet plus récent a
été attribué aux mêmes inventeurs avec l'US Patent
n°6 455 304 (24SEP02) pour la production dans
Escherichia coli et des Streptococcus acapsulaire qui
a été attribué à l'University of Oklahoma, cette fois.
L'US Patent n°6 423 514 (23JUL02) de Millenium
Pharmaceuticals couvre la séquence de l'enzyme
humaine.
     
91. La production du collagène dans des hôtes
hétérologues a été envisagée dès que l'encéphalite
spongiforme a fait son apparition. C'est, en effet,une
protéine extraites des os et de la peau des bovins pour
être commercialisée sous forme de gélatine qui est un
collagène partiellement dégradé.
La firme Genotypes (une société de recherches
sous contrat) a breveté, avec la firme Cohesion
Technologies qui fabrique des produits médicaux
résorbables, et sous l'US Patent 6 413 742 (02JUL02)
la production de collagène recombinant chez une
levure.
FibroGen produit également du collagène en
exprimant des prolyl hydroxylases dans la levure
Pichia pastoris et envisage de le produire dans des
plantes (voir le §139).Industrial BioProcessing 24
(SEP02).On trouvera dans l'US Patent 6 451 557
(17SEP02), faisant suite à deux brevets australiens
[AU] PO-3310 (290CT96) et [AU] PO-4306
(19DEC96) attribués au CSIRO australien, une
description de la production de protéines de type
collagène dans la levure.
     
Les Protéines et les Enzymes
92. La production, la manipulation en vue d'une
utilisation industrielle se développe dans le cas de
certaines enzymes. On trouvera dans Current Opinion
in Biotechnology 13 (AUG02), la série annuelle de
revues sur ce sujet.###
Pour pouvoir mener des études sur les
caractéristiques des protéines, la production en
grandes quantités de ces protéines facilite
grandement le travail. Les techniques de production
de protéines recombinantes doivent donc être
performantes et l'article de GP Lin Cereghino et al.;
p.329-332, décrit les avancées récentes dans la
production chez la levure méthylotrophe Pichia
pastoris.
On peut exprimer des protéines hétérologues aussi
bien intra- qu'extracellulairement et des modifications
post-traductionnelles sont possibles. L'induction
efficace par le méthanol n'est parfois pas souhaitable,
dans les fermentations alimentaires par exemple, ou à
cause de l'inflammabilité (on en manipule alors de très
grandes quantités dans des fermenteurs industriels).
Des promoteurs alternatifs à AOXI de la levure ont
donc été sélectionnés comme ceux de GAP, FLDI,
PEX8 et YPTI.On en trouvera des détails dans une
revue antérieure du même groupe (J Lin Cereghino et
al.; FEMS Microbiology Reviews 24 (JAN00) 45-66).
17
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
La purification des protéines par immunoaffinité
est une des techniques très utilisées, du fait de sa
spécificité étroite.Elle présente le défaut de ses
qualités,car on a beaucoup de mal à libérer les motifs
capturés et des traitements drastiques doivent alors
être utilisés.RR Burgess et al.; p.304-308 indique
comment on peut identifier des anticorps
monoclonaux qui reconnaissent spécifiquement, mais
relarguent, en conditions non dénaturantes,des motifs
reconnus.La revue fait également le tour des motifs
de purification, notamment par utilisation des
épitopes immunitaires.
Les réseaux protéiques font usuellement appel
surtout aux anticorps monoclonaux,mais on voit
apparaître de nouvelles techniques. Ainsi H Petach et
al.; p.309-314 décrivent une technique faisant appel à
des photoaptamères.Un photoaptamère positionne,
après fixation de son "ligand"un nucléoside
photoréactif au voisinage d'un tryptophane, de sorte
que sous irradiation UV, un pontage covalent très
spécifique se forme. Ceci permet un lavage énergique
et, donc, une diminution du bruit de fond.
Les réseaux de peptides de séquences définies
permettent de piéger les molécules reconnaissant
leurs motifs,et donc des molécules potentiellement
actives sur une protéine présentant ces motifs.
U Reimer et al.;p.315-320, font le tour de leurs
applications dans la cartographie des épitopes d'une
protéine et la révélation des interactions
protéine/protéines en général, ainsi que les
interactions enzymes/substrat ou /inhibiteurs.
Certaines protéines sont trop grosses pour qu'on
puisse se permettre un marquage par isotopes lourds
pour la RMN. On se contente alors de ne marquer
qu'un des segments et on effectue une ligation
(RM Hofmann et al.; 297-303).
On utilise les transferts d'énergie par résonance
pour mesurer la distance entre deux molécules, le
transfert étant d'autant plus facile qu'elles sont
proches, en utilisant les techniques FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer) et LRET
(Luminescence Resonance Energy Transfer) dans ce
but.On améliore actuellement le procédé avec de
nouvelles sondes et techniques d'insertion. (T Heyduk;
p.292-296).
La quantification des protéines dans un mélange est
difficile,que ce soit en électrophorèse 2D ou en
RMN, la hauteur des pics n'étant pas
proportionnelle à la quantité de protéine.La
technique ICAT (Isotope-Coded Affinity Tagging) est
relativement nouvelle, et implique la dérivatisation
d'un mélange de protéines avec un réactif des
cystéines (encore faut-il qu'il y en est).On détermine
ainsi la masse précise par spectrométrie de masse,en
comparant avec un standard constitué par un mélange
préétabli marqué par un traceur différent. Ce n'est
cependant pas une technique parfaite comme l'indique
la revue.
Une autre moitié du numéro est consacrée
spécifiquement aux enzymes et aux techniques
enzymatiques.
Les développements de l'enzymologie en phase
organique quasi-anhydre sont soulignés par MY Lee
et al.; p.376-384. Ils discutent des avantages,mais
aussi des limitations de ces techniques, notamment
les difficultés à atteindre des cadences suffisantes de
réaction. La lyophilisation de l'enzyme en milieu
aqueux, mais en présence de certains excipients,
organiques ou pas, améliore beaucoup l'activité,
probablement en bloquant l'enzyme dans une
conformation active.
La revue de FC Marhuenda-Egea et al.;p.385-389
discutent plus spécialement de l'utilisation des
enzymes des halophiles extrêmes en phase
organique. Ils soulignent que ces enzymes peuvent
mal fonctionner en présence de faibles concentrations
salines.Leur inclusion dans des micelles inverses (eau
intérieure aux micelles) permet de les faire
fonctionner dans ces conditions, ou dans bien d'autres
conditions non favorables.
D'une façon générale, les conditions de mise en
œuvre des biocatalyseurs (enzymes comme cellules)
sont très souvent cruciales, quelles que soit les
qualités du biocatalyseur. On trouvera dans J van
Roon et al.; p.398-405, une discussion de ce point
avec l'analyse de la répartition du biocatalyseur au
sein de particules comme outil d'amélioration de
l'activité.
Des chercheurs de Novozymes décrivent les
modifications, par les diverses techniques récentes,
des hydrolases industrielles incorporées dans les
détergents (O Kirk et al.; p. 345-351), notamment
pour leur permettre de fonctionner à basse
température.
Les lipases sont très utilisées.KE Jaeger et al.;
p.390-397 font le tour de la production,de la
conformation des lipases recombinantes et
l'amélioration de l'activité par évolution dirigée et de
l'utilisation de ces enzymes.
Les problèmes de stabilité,et particulièrement de
thermostabilité, sont abordés par B Van den Burg et
al.; p.333-337 (voir également le §93). Ils confirment
qu'il ne peut y avoir de solution unique à ces
problèmes. L'importance des réseaux d'interactions
électrostatiques à la surface de la protéine est aussi
soulignée, mais cela ne facilite pas une sélection
raisonnée.
On retrouve, dans GW Huisman et al.; p.352-358,
l'idée que les enzymes doivent être adaptées aux
procédés, et pas l'inverse, au besoin en combinant des
étapes chimiques et biologiques en tant que de besoin.
les auteurs illustrent leur propos avec un procédé
industriel de production d'un précurseur
pharmaceutique. On retrouvera d'autres exemples dans
l'article de J Ogawa et al.; p.367-375.
Les avancées dans la bioproduction à grande échelle
par des procédés enzymatiques, en Europe et au
Japon, est l'objet des deux revues de A Schmid et al.;
p.359-366 et de J Ogawa et al.; p.367-375.
Deux des articles soulignent pourquoi les idées
préconçues sont souvent très dangereuses dans les
anticipations ( GW Huisman et al.; p.352-358 et
MY Lee et al.; p.376-384).
     
93. La lipase L1 de B.stearothermophilus L1 est
une des lipases bactériennes les mieux caractérisées.
Sa forme mature est très thermostable et thermoactive
avec une Topt de 68° sur huile d'olive.
18
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
L'utilisation des lipases dans des synthèses
organiques est de plus en plus répandue. Les lipases
acceptent,en effet, des esters non naturels comme
substrats et fonctionnent bien dans des solvants
organiques où elles sont stables. On désire le plus
souvent synthétiser des substances chirales et,donc,
une bonne enantiosélectivité est requise.
Un plasmide d'expression codant une lipase
thermophile, LipA, d'un autre Bacillus sp. (Tp10A.1)
est décrit par des chercheurs australiens et néo-
zélandais. Ils ont analysé les caractéristiques de
l'enzyme recombinante. C'est une vraie lipase dont la
Topt est de 60° et le pHopt de 8,0. Elle préfère les
acides gras longs et présente une forte
enantiosélectivité.A Sunna et al.; Enzyme and
Microbial Technology 31 (02SEP02) 472-476.
     
94. Des phytases de microorganismes comme
Bacillus sp., Klebsiella aerogenes, bactéries
ruminales,Aspergillus niger, A. fumigatus,A.
terreus,Myceliophthora thermophila et de plantes.
Si on compare toutes ces phytases, on constate que
celle d'E.coli présente l'activité spécifique la plus
élevée (environ 8 fois plus élevée que celle la plus
commercialisée d'A.niger. Elle a les mêmes
propriétés cinétiques que la phosphatase codée par
appA.
Le gène de la phytase d'Escherichia coli a été
séquencé et comparé avec le gène appA. Ce n'est
qu'un mutant du gène de la phosphatase acide.
G Miksch et al.; Applied Microbiology &
Biotechnology59, n°6 (SEP02) 685-694. ###
L'US Patent 6 391 605 (18MAY02) de Roche
Vitamins porte sur des phytases modifiées
d'Aspergillus fumigatus.
     
95. Les phénoloxydases transfèrent un électron
d'un donneur, usuellement un composé phénolique,
sur l'oxygène moléculaire. Si le donneur peut être
très varié, l'accepteur est spécifiquement limité à
l'oxygène moléculaire. Dans l'industrie des
détergents, ces enzymes sont utilisées pour éviter le
transfert d'une teinture d'un tissu à l'autre.Mais la
majorité de ces enzymes ont des pHopt acides. Les
gènes de phénoloxydases de Bipolaris spicifera,
Curvularia pallescens et Amerosporium atrum ont
été clonées, exprimées et brevetées par Genencor
International sous l'US Patent n°6 399 329
(04JUN02) déposé le 21DEC99.###
     
96.Dans plusieurs procédés où le peroxyde
d'hydrogène est un sous-produit, ou dans d'autres où
il est utilisé pour blanchir ou désinfecter (lentilles de
contact et lait, par exemple), on cherche à s'en
débarrasser en fin de processus,et on utilise des
catalases.On peut également utiliser ces catalases
pour des époxydations ou des hydroxylations. Les
catalases actuellement commercialisées proviennent
de champignons filamenteux ou de foie de bœuf.
Diversa vient de breveter de telles catalases de Deleya
(Alcaligenes) aquamarinus et de Microscilla
fulvescens.US Patent 6,410,290 (25JUN02) déposé le
05OCT99.
     
97. Les haloperoxydases ne sont pas rares dans la
nature et se retrouvent dans tous les organismes. Elles
sont probablement à l'origine des composés
halogénés naturels. Il existe trois types de
haloperoxydases suivant leur spécificité.Les
chloroperoxydases permettent de chlorer, mais
également de bromer et d'ioder des composés
organiques, les bromoperoxydases ont une spécificité
pour les seuls brome et iode, tandis que les
iodoperoxydases ne manipulent que l'iode
(probablement un problème de taille du site actif).
Les premières haloperoxydases caractérisées ont été
des hémoprotéines, mais il existe également de
nombreuses haloperoxydases non-hème, dont
certaines utilisent un atome de vanadium. C'est le cas
des chloroperoxydases des champignons Curvularia
inaequalis (Brevet mondial WO 95/27046 et
Curvularia verruculosa (Brevet mondial WO
97/04102).
Deux brevets américains de Novozymes décrivent
des séquences modifiées de ces enzymes avec
l'US Patent n°6,410,291 (25JUN02) déposé le
11APR01, avec une priorité danoise du 14APR00
(DK2000 00626) et l'US Patent 6,410,292 (25JUN02)
déposé conjointement avec Maxygen le même jour.
     
98.Clostridium cellulovorans (ainsi que beaucoup
de microorganismes anaérobies) produit un
complexe cellulolytique multienzymatique dénommé
cellulosome (voir le Bulletin de Mai §105). Chacune
des sous-unités catalytiques est fixée par un domaine
appelé dockerine sur un des multiples domaines
appelés cohésines d'une protéine échafaudage,
reconnaissant spécifiquement les dockerines. L'étude
de la contribution des différentes sous-unités est
difficile. On peut en monter des synthétiques et,
ainsi, conférer des propriétés nouvelles ou étudier les
synergies. C'est ce qu'on fait des chercheurs de Davis.
Ils on utilisé la protéine échafaudage CbpA tronquée
(ne comportant que le domaine liant la cellulose et
deux sites cohésine et greffé sur elle, soit
l'endoglucanase EngE, soit l'endoglucanase EngH, soit
l'exoglucanase ExgS. L'assemblage d'ExgS et d'EngH
accroît l'activité sur la cellulose cristalline sans
modifier celle sur cellulose soluble.
Une synergie existe entre EngE ou EngH et ExgS,
lorsqu'on les utilise de façon séquentielle, ce qui n'est
guère étonnant,les unes découpant la chaîne en
grands fragments, et l'autre en égrenant du cellobiose
à partir de ces fragments. K Murashima et al.; Journal
of Bacteriology 184, n°18 (SEP02) 5088-5095.
     
Les xylanes sont très abondants dans les tissus
végétaux.Ce sont des polymères enchaînant en 1,4
des -d-xylopyranosyles.Ils sont, en fait, hétérogènes
et contiennent de nombreux motifs non xylosiques
comme O-acétyl, arabinose, acides férulique, p-
coumarique et uroniques. Ces décorations gênent la
dégradation complète par les xylanases.
Les xylanes des bois dits "durs" (hardwood) sont
très acétylés en C3, et il faut utiliser des estérases pour
faciliter la dégradation par les xylanases.
19
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Des acétyl estérases sont utilisées dans ce but (et
également pour faciliter, dans d'autres procédés,
l'action des pectinases). Il n'est donc pas étonnant que
les champignons des pourritures du bois en
possédassent et que les acétyl estérases fongiques
aient une spécificité pour les xylanes très estérifiés.
C'est pourquoi on les dénomme acétyl xylanes
estérases.On en trouve plusieurs formes chez
Trichoderma reesei, par exemple. L'acétyl xylanes
estérase la plus répandue commercialement est celle
d'Aspergillus ficuum.
Le prétraitement à la vapeur des bois durs libère de
grosses quantités d'hémicelluloses, dont les xylanes,
mais peu utilisables dans les aliments pour animaux
vu leur degré d'acétylation, malgré leur prix moins
élevé que celui des hémicelluloses des bois tendres
Son gène et les séquences régulatrices
correspondants ont été clonés par des chercheurs
coréens et exprimés chez la levure Pichia pastoris.
L'activité d'un filtrat de cultures recombinantes est
100 fois plus forte que pour l'Aspergillus d'origine.
Les deux enzymes ont les mêmes conditions
optimales (37° et pH 7,0), l'acétyl xylanes estérase
recombinante,ayant une meilleure activité en
conditions légèrement alcalines mais étant moins
stable au dessus de 55°. HJ Chung et al.; Enzyme and
Microbial Technology 31 (02SEP02) 384–391.
     
L'Agroalimentaire
100. La production de levure de boulangerie est
assurée par le procédé fed batch durant lequel on
complète le milieu au fur et à mesure que la culture
avance. Ceci permet d'obtenir un rendement élevé en
biomasse et une forte concentration cellulaire. La
quantité de substrat rajoutée doit être soigneusement
ajustée pour éviter que la levure ne se livre, si le
substrat est en excès, à la production fermentaire
d'éthanol,même en aérobiose (effet Crabtree) ce qui
est nuisible au rendement en biomasse.
Vers la fin de la phase de production,on ralentit la
croissance pour éviter une fermentation liée à la
limitation en oxygène. Enfin, on carence la levure en
azote pour qu'elle accumule des réserves carbonées,
dont on pense que cela renforce sa résistance durant le
stockage.Enfin durant les phases de lavage,
d'emballage et de stockage la levure est soumise à une
carence totale.
L'accumulation de tréhalose et de glycogène a été
suivie, car on suppose qu'il conditionne la résistance
aux stress de la conservation, de la congélation-
décongélation et osmotique notamment. La teneur en
tréhalose d'une levure fraîche est élevée (10-14%
w/w). Enfin on cherche à lui faire stocker de quoi
redémarrer rapidement la fermentation lors de son
utilisation par le client. Mais les facteurs
indispensables de ce dernier point de vue sont mal
connus.
Les chercheurs de Danisco-Cultor ont suivi les
changements dans une levure industrielle à un taux
de croissance de 0,2/heure, suivie par une carence en
azote ou en carbone.H Jørgensen et al.;Applied
Microbiology & Biotechnology 59, n°2-3 (JUL02)
310-317.La carence en azote induit bien
l'accumulation de tréhalose et de glycogène, dont la
teneur quadruple et double respectivement après 8
heures de carence. La carence en carbone entraîne
une conversion partielle du glycogène en tréhalose.
Lors du stockage pendant au moins un mois, c'est
surtout le glycogène qui est consommé. La carence
en azote entraîne une baisse de 40% de la capacité
fermentative, alors que celle en carbone reste
inchangée.
     
L'utilisation des réseaux ADN de la levure
Saccharomyces cerevisiae pour explorer les souches
œnologiques est décrite dans une revue de chercheurs
de Valencia,JE Pérez-Ortin et al.; Journal of
Biotechnology 98 (25SEP02) 227-241. Elle porte à la
fois sur l'identification des souches et sur leur
métabolisme.
L'idée de voir ce qui se passe lors de la
fermentation du vin est tentante, car l'extrapolation
de souches de laboratoire comme la souche S288c
qui à été séquencée ou boulangères ne donne pas
forcément une idée exacte de ce qui peut se passer
pour les levures œnologiques dans ce milieu
complexe et agressif qu'est le moût du vin.
L'origine de ces levures est l'objet de controverses.
Les uns pensent que ce sont des levures communes
des fruits, ce qui n'a rien d'original, d'autres que c'est
un hybride complexe issu de la sélection par les
vignerons qui passe son temps à circuler des caves
vinicoles aux vignes, et vice-versa. On ne peut nier la
forte pression de sélection en faveur d'une forte
production alcoolique, accompagnée par la résistance
correspondante et une résistance à l'acidité, plus
l'apport de métabolites secondaires éventuels .
La souche de laboratoire la plus étudiée est une
souche hétérothallique récoltée en 1938 d'une figue
californienne pourrie,S288c. La séquence de levure
stockée dans les banques de données est celle d'un
dérivé particulier de la souche S288c, FY1679.
La plupart des souches de laboratoire sont, soit
haploïdes, soit diploïdes, avec des chromosomes de
longueurs définies. Les souches œnologiques sont
souvent diploïdes, parfois aneuploïdes (avec des
trisomies ou tétrasomies fréquentes), ou polyploïdes.
Ceci explique la difficulté des croisements,mais
permet manifestement une variabilité utile dans des
environnements changeants. Le dosage de gènes utiles
pour la fermentation du moût est également facilité.
La souplesse génétique de ces souches a été
montrée avec des réseaux ADN en 1999 (TL Ferea et
al.; Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 96 (17AUG99) 9721–9726). Une souche clonale
diploïde isogénique a été cultivée pendant 250
générations en glucose limitant et dans trois
fermenteurs différents. La population des trois
fermenteurs a été analysée à l'issue de cette période.
Plusieurs centaines de gènes montraient alors une
modification dans leur expression. Le plus
intéressant est que les trois fermenteurs ont donné des
résultats quasi-identiques sous la pression de
20
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
sélection du glucose limitant. Les mécanismes ayant
entraîné ces modifications n'ont pas été étudiés,mais
apparaissent comme des mutations ponctuelles dans
quelques gènes régulateurs.
Toutes ces souche sont restées diploïdes, bien que
ces souches soient homothalliques (autofertiles en
principe) et très hétérozygotes, comme l'ont montré,
autrefois, les chercheurs de l'INRA Montpellier.
Il n'y a pas eu de gros changements liés à la
réorganisation du génome, bien qu'on sache que
quand un gène important devient non fonctionnel,on
a une pression de sélection en faveur d'une acquisition
compensatoire d'un deuxième chromosome entier. Les
chercheurs de Montpellier avaient déjà montré que les
levures œnologiques sont capables de réorganiser
leurs chromosomes au cours de la mitose.
Des translocations du gène de résistance aux
sulfites SSU 1,ont été détectées ainsi que des copies
supplémentaires des gènes ADH 2 et ADH 3, dans
des souches spéciales de la fermentation des vins de
Jerez oxydant l'éthanol et intervenant dans la phase
finale de vieillissement du vin (voir B Esteve-Zarzoso
et al.;Applied and Environmental Microbiology 67
(MAY01) 2056-2061). D'une façon générale,ces
remaniements limitent (au moins dans un premier
temps) les possibilités de modifications génétiques
des levures œnologiques, car elles sont rapidement
éliminées par conversion génique ou recombinaison
homologue et les multisomies contraignent à modifier
tous les homologues si on veut obtenir une souche
stable..
Si on s'intéresse, maintenant, aux régulations, on
constate que chaque souche s'exprime
différemment selon les critères des réseaux
d'expression (transcription seulement) mais,
curieusement,c'est également le cas pour les souches
de laboratoire. Il faudrait donc étudier cette expression
pour chaque vin.
On admet généralement que les souches
œnologiques sont en carence d'azote dans le moût. Il
en résulte que les gènes impliqués dans les synthèses
d'acides aminés et de purines sont, en général,très
fortement exprimés.
Au début de la fermentation, quand l'azote n'est
pas trop limitant, la concentration en sucres induit un
métabolisme fermentaire et les gènes de la glycolyse
sont fortement exprimés (mais voir le Bulletin de
Septembre §81 pour les déductions qu'on peut en
tirer), tandis que les gènes du métabolisme oxydatif
sont réprimés. En carence d'azote, on constate la
surexpression de plusieurs gènes qui sont
normalement sous une régulation négative par le
glucose. Dans ces conditions une fraction
importante du glucose persiste dans le milieu. Il se
pourrait que ce soit dû à un basculement vers la
respiration liée à ce que l'on appelle l'effet Pasteur.
Cet effet a longtemps été considéré comme inexistant
chez les levures de laboratoire, mais pourrait bien
avoir lieu chez les levures œnologiques.Ceci
expliquerait le blocage de certaines fermentations qui
peuvent être levés par l'addition d'une source d'azote.
Dans la souche œnologique T73 le gène YHB 1,
codant une flavohémoglobine qui est normalement
surexprimé dans les conditions aérobies, l'est très peu.
Ceci est probablement lié à une petite délétion dans
son promoteur.
La résistance aux fortes concentrations d'éthanol
a nécessité de nombreux remaniements de la
membrane plasmique (acides gras, stérols et
phospholipides). La résistance aux traitements
antibiotiques comme les sulfites, le sulfate de
cuivre,etc… suppose également des mécanismes
détoxifiants.On a cependant des surprises, car le gène
CUP1 est moins exprimé dans la souche œnologique
T73 que dans la souche de référence S288c. Le gène
de résistance aux sulfites SSU 1 est surexprimé, et on
sait que c'est lié à un réarrangement dans son
promoteur. ###
     
102. Une revue sur l'ingénierie métabolique de
Lactococcus lactis, par des chercheurs de
Wageningen et du NIZO néerlandais, est parue avec
MKleerebezem et al.; Journal of Biotechnology 98
(25SEP02) 199-213.
La dérivation du flux du métabolisme du pyruvate
vers d'autres produits que l'acide lactique comme le
diacétyl ou l'alanine a été explorée. Les productions
d'exopolysaccharides, modifiant la texture des
produits laitiers ou d'acides foliques l'ont également
été, ainsi que l'amélioration de certains aliments,soit
par addition, soit par élimination.
Le système d'expression régulé par la nisine
(NICE) a surtout été utilisé. Pour arriver à modifier
ces voies il faut, cependant,bien les connaître.Elles
sont,cependant, relativement simples par rapport à
d'autres bactéries ou la levure.
Le pyruvate est un intermédiaire métabolique
central. Il peut être converti en divers produits comme
les acides lactique et acétique, l'éthanol, le diacétyl,
l'acétoïne et 2,3-butanediol,par exemple. L'acide
lactique est prépondérant, car c'est le principal puits à
électrons.
Le diacétyl est un élément important de l'arôme
des produits laitiers frais (spécialement le beurre et
une plaie des boissons alcoolisées). C'est la production
du diacétyl qui a été la première voie abordée en
ingénierie métabolique.La technique de loin la plus
efficace dans ce domaine est de jouer sur la balance
redox (rapport NADH/NAD
+
).La réduction du
pyruvate par la lactate déshydrogénase est équilibrée
par le transfert du pouvoir réducteur du NADH issu de
la glycolyse sur le produit final. On peut la perturber
en agissant sur ce co-facteur grâce à une
surexpression d'une NADH oxydase. On peaufine la
régulation en jouant avec l'aération du milieu. La
bactérie bascule alors vers une production d'acides
acétique et d'acétoïne, avec une production dérivée de
diacétyl.
On sait,en jouant sur les souches et les paramètres
de fermentation, piloter sa production mais, en
conditions industrielles, cela n’est pas facilement
praticable (l'aération est nuisible aux autres bactéries
lactiques et perturbe la texture). Il vaut donc mieux
avoir des souches surproduisant sans conditions. C’est
un sous-produit du métabolisme du pyruvate chez
Lactococcus lactis. L’enzyme clé de la voie,
l’acétolactate synthase, condense deux pyruvates en
-acétolactate et CO2, Quand la concentration
21
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
intracellulaire de pyruvate est forte, une partie de
l’acétolactate est alors décarboxylé en acétoïne par
l'
-acétolactate décarboxylase, et une faible partie
va être oxydée spontanément en diacétyl. L’-
acétolactate est, en effet, lentement décarboxylé en
diacétyl en présence d’oxygène.On peut convertir
70% du pyruvate en diacétyl chez des mutants aldB
dépourvus d'
acétolactate décarboxylase. Il faut
cependant éviter la présence de diacétylréductase qui
le reconvertit en acétoïne sans arôme.
On peut également renforcer la production
d'acétaldéhyde (arôme des yaourts) par la même
technique de manipulation redox.
     
103.Christian Hansen A/S,vient de breveter des
bactéries lactiques recombinantes possédant une
activité élevée (ou atténuée) en diacétyl réductase
pour une utilisation alimentaire. US Patent 6 413 765
(02JUL02).
     
104.Des chercheurs finlandais ont construit un
nouveau vecteur pour bactéries lactiques.
L'utilisation de la nisine est acceptée en alimentaire
dans plus de cinquante pays. Ce vecteur est donc basé
sur le gène nisI d'immunité à la nisine Z (une
bactériocine produite par les Lactococcus). Il ne
comprend que des séquences de lactocoques (réplicon
pSH71, gène nisI sous la commande du promoteur
permanent P45).
Il a été utilisé chez une souche industrielle de
L.lactis, et pour exprimer le gène pepI de proline
iminopeptidase de Lactobacillus helveticus dans
Lactococcus lactis et Lactobacillus plantarum.
Les premiers systèmes de ce type utilisaient le gène
de marqueur de résistance nsr de Lactococcus lactis,
mais ce dernier n'est pas présent chez les souches de
L.lactis productrices de nisine. La production de
nisine fait appel à onze gènes dans deux opérons,
nisZ/ABTCIPRK et nisFEG et la bactérie se protège
des perforations membranaires par la protéine
d'immunité NisI et un complexe translocateur
potentiel de type ABC (ATP Binding Cassette)
NisF/E/G.NisI est nettement plus efficace que le
translocateur de ce point de vue (montré par les
délétions respectives). Cependant les L.lactis
possédant un niveau normal de NisI, et sans autre
gène des opérons nisine, ne montrent une immunité
qui n'est que très limitée à la nisine.L'action
conjointe du transporteur est donc nécessaire.
L'immunité est, malgré tout et après surexpression,
suffisante pour la sélection.
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107. Archer-Daniels-Midland vient de breveter
sous l'US Patent 6 413 736 (02JUL02) une Phaffia
rhodozyma surproduisant (plus de 3000 ppm)
l'astaxanthine.
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108. La viscosité des aliments dans l'intestin est un
gène pour l'élevage aviaire. Celle-ci est
essentiellement due aux arabinoxylanes et 
-
glucanes. Des chercheurs de l'INRA à Tours et
Nantes montrent que l'utilisation conjointe de
xylanases et 
-glucanases est plus favorable qu'une
utilisation séparée, ce qui semble raisonnable. Ils
montrent, cependant, que des préparations
enzymatiques impures, contenant
arabinofuranosidases, xylosidases,glucosidases,
galactosidases,cellulases et polygalacturonase sont
bien préférables de ce point de vue. Ils soulignent, au
passage, que l'effet est variable selon les matières
premières (et donc leur composition). Ils ont examiné
l'effet sur un large spectre de ces matières premières
plusieurs cultivars de blé (Rialto, Sideral, Isengrain),
leurs dérivés comme le son, mais aussi la plupart des
autres céréales,les tourteaux de soja, de colza et de
tournesol, le pois fourrager. N Mathlouthi et al.;
Journal of Agricultural & Food Chemistry 50
(28AUG02) 5121-5127.
     
110. La flaveur de la bière se dégrade lentement
avec le temps, ce qui est lié à l'accumulation de
certaines substances comme le trans-2-nonénal,la -
damascenone et le diméthyl trisulfure. On peut
diminuer la quantité de -damascenone en élevant le
pH, car cela diminue l'hydrolyse acide des glucosides.
On provoque, par contre, le formation de
(methylthio)propionaldéhyde,du fait de la réaction
de Strecker sur la méthionine qui donne des produits
qui sont immobilisés par des composés sulfitiques à
pH acides, mais libérés à pH plus haut et oxydés en
acide 3-(méthylthio)propionique qui est le
précurseur du diméthyl trisulfure.L Gijs et al.;
Journal of Agricultural & Food Chemistry 50
(25SEP02) 5612-5616.
     
Les probiotiques
112. Les fruits des régions tempérées présentent
usuellement une partie charnue abondante et laissent
peu de résidus.(pelures,graines et noyaux). Les fruits
tropicaux ou sub-tropicaux sont en général différents
de ce point de vue et donne lieu à une production
grandissante de ces déchets propices aux
contaminations microbiennes. Une revue discute des
utilisations possibles de ces résidus pour en tirer des
composés fonctionnels utilisables en alimentation,
dont des antioxydants.A Schieber et al.; Trends in
Food Science & Technology 12 (NOV01) 401-413.###
     
113. La production d'huile d'olive est une activité
extrêmement polluante dans des pays où l'eau est
rare. Les déchets issus du traitement d'une tonne
d'olives sont, d'une part, 500 à 1100 litres d'"eaux
noires"et d'autre part les noyaux dont on extrait les
résidus d'huile pour les vendre sous formes d'huiles de
seconde qualité,avant de les broyer et de les vendre
comme aliments pour les animaux ou comme
carburant. Ces effluents aqueux sont riches en
antioxydants,notamment en dérivés d'hydroxytyrosol
et en oleuropéine.
22
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
On peut extraire une solution plus concentrée
d'hydroxytyrosol des feuilles d'olivier que celle que
l'on observe dans l'huile et bien des tablettes
supposées anti-oxydantes de même origine,en traitant
les feuilles par une 
-glucosidase thermophile
immobilisée sur chitosan.R Briante et al.; Journal of
Agricultural & Food Chemistry 50 (14AUG02) 4934-
4940.
     
114. La chicorée contient des composants anti- et
pro-oxydants solubles. La cuisson entraîne la
disparition des pro-oxydants.A Papetti et al.;Journal
of Agricultural & Food Chemistry 50 (31JUL02)
4696-4704.
     
115. Le sort des antioxydants (phénols et vitamine
C) dans les jus d'orange préparés selon les cinq
techniques usuelles (pressage, pasteurisation légère,
pasteurisation normale, concentration et congélation)
a été suivi par des chercheurs de Murcia. A Gil-
Izquierdo et al.; Journal of Agricultural & Food
Chemistry 50 (28AUG02) 5107-5714.
Le pressage industriel extrait 22% plus de ces
produits que le pressage manuel domestique.
La congélation entraîne une disparition massive de
l'activité des phénols, la concentration n'entraînant
qu'un effet plus atténué. La pasteurisation entraîne
une diminution d'environ 30%, notamment des dérivés
d'acide caféique, de la vicénine 2 (apigénine 6,8-di-C-
glucoside) et de la narirutine (5,7,4'-
trihydroxyflavanone-7-rutinoside).
Le contenu en vitamine C (qui fournit 77-96% de
l'activité antioxydante du jus) est plus fort (25% de
plus) après le pressage industriel qu'après pressage
domestique. La pasteurisation améliore fortement la
concentration en vitamine C par extraction des
parties solides.Concentration et congélation ne
modifient pas la teneur. Pasteurisation, concentration
et congélation ne modifient pas l'activité globale
antioxydante du jus, mais la diminue d'environ 50%
dans la pulpe.
     
116. Mangez des morilles (Morchella esculenta)
tous les jours, et vous vous porterez mieux. Il existe,
en effet, dans les carpophores des galactomannanes
de très grande taille (environ 1 MDa, et environ 2%
du poids sec) qui est un immunostimulateur.
CJ Duncan et al.; Journal of Agricultural & Food
Chemistry 50 (25SEP02) 5683-5685.
     
La sécurité alimentaire
117. Les ruminants (dont les bovins) sont un
réservoir important des Escherichia coli produisant
la shigatoxine (STEC) qui sont un groupe d'E.coli
causant des entérites.On cherche à limiter ces
infections transmises par les bouses.
Les infections des veaux par des STEC varient de la
dysenterie à des infections inapparentes suivant le
phénotype.Les sérotypes non-O157 portent le gène,
efa1 (E
.coli f
actor for a
dherence), qui permet
l'attachement aux cellules intestinales). Chez les E.coli
entéropathogènes (EPEC),on trouve un gène quasi-
identique, lifA, codant la lymphostatine, qui empêche
la prolifération des lymphocytes activés par ce que
l'on appelle les mitogènes (par les MAPK) et la
production des cytokines pro-inflammatoires. Ces
deux gènes ont donc des fonctions différentes.
L'étude des sérotype O5 et O111 des STEC indique
que la colonisation de l'intestin des bovins exige Efa1.
L'intimine de la membrane externe d'E.coli O157:H7
est exigée pour la colonisation de l'intestin de veaux
nouveau-nés privés de colostrum.Son récepteur n'est
autre que la protéine bactérienne Tir injectée dans la
cellule par un système de sécrétion de type III). Mais
ce n'est manifestement pas le seul.
Le gène efa1/lifA est présent dans les STEC O111
et les EPEC et des entéropathogènes comme
Citrobacter rodentium, Hafnia alvei, et les EPEC
cunins. Quoique les E.coli O157:H7 ne possédassent
pas un gène efa1 complet, mais uniquement une
version tronquée (qui reste partiellement
fonctionnelle) portée par le chromosome. Il existe,en
outre, un gène toxB chez les E.coli O157:H7 qui ont
une extrémité N-terminale plus ou moins commune,
ayant des homologies avec la partie N-terminale des
toxines A et B de Clostridium difficile.MP Stevens et
al.; Infection and Immunity 70 (SEP02) 5158-5166.
     
118.Salmonella enterica sérovar Enteritidis a
remplacé le sérovar Typhimurium comme cause
d'entérites dans beaucoup de pays. Une des sources
principales d'infections est la viande de volailles
contaminées. Un des gènes intervenant dans la
virulence de Salmonella enterica sérovar Enteritidis
révélé par une analyse massive (avec inactivation par
un mini-Tn5) de ce type de gènes est celui,pbpA2,
d'une protéine liant la pénicilline. Il existe,chez ce
sérovar,deux exemplaires de ce gène, mais
manifestement avec deux fonctions différentes car ils
ne donnent pas lieu à une complémentation (voir le
§46). L 'article souligne, en fait que plusieurs gènes
métaboliques sont impliqués dans la virulence
(comme une thréonine désaminase ou une 4-
hydroxybutyrate coenzyme A transférase),qui
correspond à une adaptation métabolique à
l'invasion des macrophages du poulet. Y Zhao et al.;
Infection and Immunity 70 (SEP02) 5319-5321.
     
120. Les Campylobacter coli des porcs et porcelets
diffèrent d'un animal à l'autre. Il n'y a pas de
corrélation entre les génotypes bactériens d'un
porcelet et de la truie correspondante, par exemple,
ou entre porcelets d'une même portée. Il doit donc
coexister de nombreux génotypes dans un élevage.
ME Hume et al.; Current Microbiology 45, n°2 (02)
128-132.
     
23
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
121.Un certain nombre d'indispositions liées à la
consommation de moules irlandaises sont causées par
de nouvelles toxines dites azaspiracides. Ces
azaspiracides se comportent de façon différente des
autres toxines de type polyéther, de sorte que les
techniques officielles de détection sur la souris donne
alors de faux-négatifs.JKJ Lehane et al.; Food
Additives & Contaminants 19 (JUN02) 555-561
     
122. Les niveaux de contamination en métaux
lourds,nitrates et nitrites, ainsi que de mycotoxines
de quinze produits alimentaires "biologiques " et
"conventionnels", dont viande, lait, œufs, légumes et
céréales, ont été examinés par des chercheurs de
l'INAPG.Les niveaux moyens ont été comparés avec
les limites recommandées ou réglementaires. Le
niveau maximum réglementaire est dépassé pour le
plomb dans des carottes et du sarrasin "biologiques
"ainsi que dans du blé conventionnel. Pour le
cadmium, ce maximum autorisé est dépassé dans le
sarrasin conventionnel et "biologique". Pour les
nitrates le niveau autorisé est dépassé dans des
épinards "biologiques", mais on pouvait s'en douter,
ce légume ayant une forte tendance à accumuler les
nitrates. Pour la patuline (une mycotoxine) on la
trouve à des doses supra-légales dans des pommes
"biologiques" du fait, probablement, de l'absence de
traitements fongicides. Les contaminations par la
mycotoxine désoxynivalénol qui n'est, il est vrai,
jamais toxique de façon aiguë, mais qui est présent
dans les blés"biologiques" comme conventionnels,
avec une prédominance attendue dans les
blés"biologiques" Le risque le plus important est bien
celui des mycotoxines des pommes et du blé, car
elles constituent l'essentiel de la contribution à
l'exposition aux risques. L Malmauret et al.;Food
Additives & Contaminants 19 (JUN02) 524-532
     
123. Les thons de la Méditerranée contiennent du
mercure et du méthylmercure au-delà des
concentrations maximales autorisées dans la CEE,
soit Hg = 1 mg/g de poids humide, et cette
concentration varie de 0,84 à 1,45 mg/kg, avec une
moyenne de 1,17mg/kg pour l'albacore et 0,16 à 2,59
mg/kg et une moyenne de 1,18 mg/kg pour le thon
rouge. On constate que 79% des thons albacore et
61% des thons rouges dépassent les normes. Le
mercure est presque totalement sous sa forme
méthylée,la plus dangereuse. Il y a ce qui est présent
et ce que l'on ingère en moyenne. La situation est plus
grave encore, avec une dose hebdomadaire très au
delà de ce qui est indiqué dans les "Provisional
Tolerable Weekly Intake" des deux espèces.
MMStorelli et al.; Food Additives & Contaminants
19 (AUG02) 715-720.
     
124.Penicillium et Aspergillus sont responsables de
la production des deux mycotoxines patuline et
citrinine dans les pommes présentant des tâches de
pourriture dont il faut se méfier. Les fruits contaminés
sont faciles à distinguer, mais pas les jus et autres
préparations. Les seuils de détection de la patuline et
de la citrinine sont respectivement de 120-130 et 15-
20 g/kg.Les contaminations par la patuline sont plus
fréquentes que celles par la citrinine,mais on peut
trouver les deux sur le même échantillon (20% des
cas),mais la citrinine n'est présente qu'à des doses
faibles.Le niveau de ces contaminations dépend des
cultivars, et seule la patuline présente un certain
danger dans les jus et confitures.ML Martins et al.;
Food Additives & Contaminants 19 (JUN02) 568-574.
     
125.Les chercheurs de Nestlé à Shanghai ont étudié
la formation d'ochratoxine A dans les baies de café
au cours de la culture, des traitements post-récolte et
la préparation des grains de café et des cafés solubles.
P Bucheli et al.; Food Additives & Contaminants 19
(JUL02) 655-665.
Aspergillus ochraceus et A.carbonarius sont les
plus forts producteurs de ces mycotoxines.(5-13
mg/kg). Le séchage des baies est la période la plus
propice à cette contamination, surtout dans les
conditions humides tropicales, et ceci durant les 3 à 5
premiers jours du séchage. C'est pourquoi les
coques,mélangées parfois avec les grains dans la
production de cafés solubles de bas de gamme, sont
dangereuses, car elles concentrent ces toxines. La
contamination au –delà de ce délai est moins
préoccupante.
     
L'Environnement
126. On trouvera dans la revue de M Dua et al.;
Applied Microbiology & Biotechnology 59, n°2-3
(JUL02) 143-152 un tour d'horizon des succès et
limitations des techniques de bioremédiation et plus
généralement de l'application des biotechnologies aux
dépollutions de l'environnement.
Trois principes de base sont impliqués dans la
décision d'utiliser une technique plutôt qu'un autre. Le
premier est d'examiner la biodégradabilité du produit
à éliminer ou à convertir en un produit moins toxique.
Le second est l'accessibilité du contaminant et le
dernier et la capacité à stimuler l'activité biologique.
Le fait qu'un produit chimique ait une demi-vie très
longue dans les sols, comme le DDT avec 3 à 10 ans,
le HCH avec 11 ans, indique qu'il y a peu de clients
pour les consommer. La question se pose donc de
savoir pourquoi,et quoi faire pour améliorer les rares
activités existantes.
De plus, s'il existe des décharges contaminées par
un seul produit, le plus souvent ce sont des mélanges
de substances non apparentées comme les sites à
radionuclides,également et souvent contaminés par
de nombreux solvants. Quand un site est fortement
contaminé, on peut utiliser la ventilation (air
stripping) du sol extrait pour éliminer les substances
volatiles,au besoin en les récupérant, ou
l'incinération dans des installations spécialisées triant
les effluents. Mais tout ceci est long et, surtout,
coûteux. Cela n'est pas praticable pour des
24
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
contaminations faibles, mais significatives, sur de
grandes surfaces.
L'utilisation des microorganismes a été pratiquée
(voir l'Exxon Valdez et plus généralement les
pollutions pétrolières). Les microorganismes ont eu le
temps de se trouver des substrats parmi l'énorme
quantité de molécules naturelles (dont les pétroles qui
ne datent pas de l'apparition de l'homme). Il existe
donc dans la nature une bibliothèque géante de voies
métaboliques et d'enzymes correspondantes,mais
elles ont été sélectionnées pour les besoins des
organismes, et pas pour dépêtrer l'homme de ses
contradictions. Cela fait que les biodégradations sont
usuellement lentes,ce qui est un de leurs principaux
défauts.
Des microorganismes ayant acquis la capacité de
dégrader benzène,phénol, naphthalène, atrazine,
nitroaromatiques, biphényls, biphényls polychlorés(PCBS) et les chlorobenzoates, sont connus. Les
aromatiques simples sont faciles à dégrader, et ceci
par plusieurs voies différentes. Les choses se gâtent
avec la présence d'halogènes greffés, d'autant plus que
les chlores sont voisins. Ceci est d'autant plus
ennuyeux que beaucoup de produits de l'industrie
humaine sont précisément halogénés (surtout chlorés)
plus ou moins abondamment. Il a fallu, pour eux, le
plus souvent faire évoluer de nouvelles voies de
dégradation. Il faut cependant se rappeler que les
organismes savent également produire des dérivés
halogénés (voir le §97).
Dans ce cas l'essentiel de l'information disponible
porte sur la dégradation oxydative, probablement
parce que les méthodes aérobies sont plus simples à
utiliser. De plus ces techniques sont plus efficaces car
menant plus efficacement à une minéralisation. Elles
utilisent des enzymes oxydatives normalement
utilisées sur des substrats naturels, et pas très
regardantes pour leur substrat. Ce sont des mono- et
des dioxygénases qui insèrent un ou deux atomes
d'oxygènes sur le cycle par une attaque électrophile
d'un carbone non substitué (ce qui explique la
difficulté de l'attaque de composés comme le HCH).
Les dégradations anaérobies commencent par un
déchloration réductive (donnant du HCl), laissant un
carbone non substitué (par un H quand même).
L'amélioration de l'activité des souches pour
pallier leur lenteur naturelle évoquée plus haut,
consistent à remodeler leurs voies utiles à l'homme,
pour qu'elles ne soient plus limitées par les besoins du
microorganisme. Il vaut donc mieux commencer une
ingénierie génétique des souches en partant de celles
qui possèdent l'essentiel des enzymes nécessaires,
pour n'avoir qu'à améliorer le débit des voies utiles
sans avoir tout à reconstituer de novo.
Ainsi la 2,3-dihydroxybiphényl 1,2-dioxygénase
de Rhodococcus RDC1 (codée par etbC) poussant sur
éthylbenzène possède un spectre de substrats
extrêmement large. La co-expression des deux 2,3-
dihydroxybiphényl 1,2-dioxygénases codées par
bphC et etbC chez une autre souche de Rhodococcus
(RHA1) poussant sur biphényl ou éthylbenzène
accroît encore le spectre des congénères de PCBs
attaqués.On s'est amusé à effectuer plusieurs
transferts de ce type avec des succès avouables.La
revue en cite plusieurs.
Une utilisation intéressante (citée dans le Bulletin
de Décembre 2001 §4) consiste à suivre la progression
de la colonisation d'un site par une souche
biodégradante en suivant une fluorescence qui n'a lieu
que quand la bactérie attaque le polluant, ce qui
indique sa présence et l'activité de la bactérie.Elle
indique, au passage, si le polluant est réellement
biodisponible.
On peut aller au-delà et améliorer les enzymes
transférées sur le plan du spectre de substrats
reconnus et de l'activité enzymatique. On peut
utiliser des mutations dirigées dans des enzymes déjà
bien connues où l'on pense qu'on sait ce que l'on fait.
C'est le cas de la haloalcane déhalogénase et de la
phénanthrène dioxygénase de Nocardioides où la
construction d'enzymes hybrides a permis de localiser
le site important pour la spécificité de l'enzyme.Mais
ces méthodes sont lentes car on ne peut explorer
qu'une substitution à la fois puis éventuellement les
combiner, avec des surprises douloureuses quand des
interférences au sein de la conformation viennent vous
décourager de tenter d'être intelligent. Mais là,comme
ailleurs, les méthodes brutales de brassage au hasard
des séquences associées au criblage des produits
donnent des résultats. Plusieurs exemples de ces
tentatives réussies sont analysés. Ils portent à la fois
sur des brassages naturels par recombinaison et sur
les recombinaisons artificielles (DNA shuffling)
Une des façons d'améliorer des dégradations
biologiques est de combiner dans un même hôte deux
voies différentes s'attaquant à une même famille de
produits. Ainsi la minéralisation (dégradation totale)
des PCBs exige deux voies qu'on ne trouve jamais
dans le même organisme. Ceci n'a rien d'étonnant, car
les intermédiaires des deux voies sont inhibiteurs pour
l'autre. En rusant un peu, on a réussi à combiner des
enzymes des différentes voies en les prélevant chez
des souches différentes. On peut encore améliorer le
processus en faisant produire par la souche modifiée
des surfactants améliorant la biodisponibilité des
polluants qui sont très souvent hydrophobes, ce qui les
rend peu accessibles.
La revue discute également de l'identification
moléculaire sans isolement ni culture.
Elle discute surtout des améliorations plus ou moins
ponctuelles et n'envisage pas une approche plus ou
moins holistique, qui n'est peut être pas encore
possible.
     
127. Il est donc utile de lire également la revue de
R Grommen et al.; Journal of Biotechnology 98
(11SEP02) 113-123, qui aborde le problème d'une
autre façon.Elle fait, par exemple, remarquer que bien
des pollutions passent inaperçues et finiront un jour
par être désastreuses. Une remarque amusante est que
beaucoup des médicaments que nous prenons passent
intégralement dans l'environnement via l'urine. Ainsi
l'éthynyl œstradiol (EE2) des pilules contraceptives
est maintenant ubiquitaire dans l'environnement.
Si on constate, la main sur le cœur, que l'Europe est
préoccupée par ces problèmes d'environnement,avec
des directives qui se succèdent sur ce plan, le respect
de ces directives est une autre affaire.
25
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Le coût de dépollution d'un kg de matière sèche est
de l'ordre de 0,5€ par incinération,de 0,05€ par voie
biologique (mais cela va moins vite, voir plus haut).
Mais l'un des avantages de la voie biologique qui n'a
pas été suffisamment souligné est celui de s'adapter
spontanément à de nouvelles situations (grâce aux
régulations propres de l'organisme) et à de nouvelles
molécules.Ainsi observe-t-on, depuis un certain
temps, l'apparition de microorganismes éliminant
l'atrazine.
La quantité d'eau disponible se réduit tous les ans.
Dans les années 90s l'agriculture consommait 2400
km
3
, les industries 800 km3, les habitations humaines
environ 250 km3. L'utilisation agricole augmente de
façon linéaire depuis 1950 (depuis qu'on a des pompes
commodes). La consommation industrielle a plafonné
depuis les années 80, mais on prévoit une reprise de
la croissance de cette consommation. La
consommation domestique continue à augmenter
linéairement,mais avec une pente sans commune
mesure avec celle de l'agriculture.
Le résultat en ait que la pollution augmente en
parallèle quand on ne peut plus atteindre les 2000 m3
par an et par individu (limite officielle d'un déficit
en eau), moins d'eau collecte plus de déchets. Il en
résulte, au moins dans les pays riches,une défiance
pour l'eau potable (qui se traduit,dans la CEE,par une
augmentation de 5% par an des ventes d'eau en
bouteille). On trouvera dans cette dernière revue des
tableaux sur les pays où la crise de l'eau est prévue en
2025,soit absolue, soit économique (l'eau n'est plus
économiquement disponible).
La méfiance du public est alimentée par de
multiples craintes,comme la présence de substances
organiques douteuses comme trihalométhanes,
nonylphénol,EE2 et autres œstrogènes ou de
microorganismes pathogènes.
Il n'est donc pas étonnant que la revue se penche
plus particulièrement sur le recyclage en eaux
potables.
Le problème a déjà été abordé depuis longtemps et
on dispose de plusieurs procédés performants. On sait
atteindre le seuil du milligramme par litre pour
beaucoup de polluants, mais, pour certains comme les
œstrogènes, c'est du nanograme par litre qu'il s'agit. Il
n'est pas certain que les microorganismes vont se
dévouer à travailler pour si peu.
Les méthodes d'épuration aérobies actuelles sont
centralisées, car cela permet d'abaisser les coûts, mais
surtout de régulariser le flux des substrats pour les
boues activées (casse-tête des stations touristiques
dont la population varie énormément entre saison et
hors-saison). Ces usines sont décriées par certains au
bénéfice du lagunage dans des marais régénérateurs.
Il faut cependant savoir que l'efficacité de ces
installations"vertes"est très mauvaise (30 à 60 jours
de séjour pour une épuration convenable).Ce procédé
est incompatible avec des adjonctions d'eaux usées
industrielles qui doivent être traitées séparément (elles
le sont généralement). De plus les détergents utilisés
doivent être biodégradables, sinon on rencontre des
difficultés. Sous les climats chauds l'oxygène fournie
par la photosynthèse des algues est suffisant pour
maintenir une concentration adéquate sur toute la
profondeur. Sous les climats tempérés, il faut utiliser
une aération si on veut utiliser une profondeur
supérieure à 1,5m. Une profondeur inférieure est
gênante,car elle permet le développement de plantes
qui colmatent le bassin. Mais l'obstacle le plus
gênant est qu'il faut 1 hectare pour 200 à 400
habitants; imaginez la taille des terrains nécessaires à
l'agglomération parisienne. La ville de Melbourne, en
Australie,a utilisé cette technique, mais je ne sais pas
si la technique est encore utilisée.Le procédé est
néanmoins utilisé sous une forme dérivée avec les
réservoirs à lisier ou l'équivalent pour les eaux
blanches des laiteries. On stocke un certain temps ces
effluents, comme on le fait pour le fumier,en laissant
une première désinfection se dérouler, puis on
pulvérise dans les champs.
Mais les techniques aérobies coûtent cher
(environ 100 € par habitant et par an dont 40% vont
aux dépenses énergétiques liées à l'aération des
bassins). De plus il n'y a pas minéralisation complète,
car une bonne partie des matières sont récupérés dans
les boues activées dont ne sait plus trop quoi faire
après. Ces boues ne sont autres que le résultat de la
prolifération de la flore qui épure l'eau en
conditions aérobies, et transformée en matière vivante.
Un nouveau champ s'ouvre actuellement pour des
procédés complémentaires utilisables à domicile (la
chasse d'eau et la baignoire n'ont pas les mêmes
exigences que l'eau potable et pourraient être
utilisatrices d'eau recyclée), l'écueil étant les
contaminations bactériennes des filtres utilisés.On
cherche justement à recycler sur place en partie les
eaux peu polluées.
L'épuration anaérobie revient nettement (2 à 3
fois) moins cher que l'épuration aérobie, car il n'y a
pas besoin d'aérer (mais il en faut pour chauffer les
bioréacteurs,voir plus loin) et le biogaz qui est
produit peut être converti en électricité et il est
considéré,jusqu'à nouvel ordre comme un carburant
vert.Il existe, de par le monde, plusieurs centaines de
ces installations, surtout pour l'épuration des effluents
industriels.Elles ont l'avantage de n'engendrer que
très peu de boues. Mais la digestion anaérobie ne
fonctionne que médiocrement à basse température.
C'est une des raisons pour laquelle une source bon
marché d'énergie est utile.On l'utilise comme
complément des stations de traitement aérobies pour
les boues. Malheureusement on se préoccupe surtout
de l'élimination du carbone et il faudrait également le
faire pour les nitrates, les phosphates et les
pathogènes.
Dans le cas des déchets solides, le compostage a
perdu un certain temps la partie il y a quelques
années, car il n'élimine qu'une partie des produits
gênants et ne laisse,à la fin, qu'un produit guère
utilisable du fait des contaminations résiduelles non
biodégradables. On assiste à un certain renouveau.
     
133. Le transposon Tn4651 de 56kb du fameux
plasmide pWW0 de Pseudomonas putida mt-2
permettant la dégradation du toluène code un
système de recombinaison site-spécifique permettant
la formation de co-intégrats.Le site cible est la
séquence res de 203pb.Deux protéines, TnpS et TnpT
sont nécessaire et codées par deux gènes associés à
26
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
res (tnpT-res-tnpS avec res pour resolution) pour
résoudre la séquence d'une part,et l'intégrer de l'autre.
Celle-ci est distante de 48 kb du gène tnpA qui code la
transposase.Ces deux gènes sont particuliers au
transposon Tn4651 au sein de la famille. La
transcription de tnpT et tnpS est divergente avec un
certain recouvrement de res. On trouve dans le produit
de tnpS les motifs en tétrade communs dans les
recombinases site-spécifiques. TnpT n'a aucune
particularité pouvant être liées à ces enzymes.Il
semble faciliter la résolution (excision).H Genka et
al.; Journal of Bacteriology 184, n°17 (SEP02) 4757-
4766.
     
134. On produit actuellement des quantités records
d'huile d'olive avec 1 225 500 tonnes,selon
l'International Olive Oil Council. Chaque tonne
d'huile engendre 3,9 à 7,5 m
3
d'eaux usées. Des
chercheurs grecs et praguois ont étudié l'utilisation des
pourritures blanches pour neutraliser les eaux usées
issues du traitement des olives vertes pour leur ôter
leur amertume (soude à 1,8-2,3%). G Aggelis et al.;
Applied Microbiology & Biotechnology 59,n°2-3
(JUL02) 353-360. Les rejets sont moins importants
dans le cas des olives de table que dans la production
d'huile,mais sont néanmoins difficiles à traiter à
cause de leur composition, mais également de leur
saisonnalité qui empêche une flore stable de s'établir.
Ces eaux sont fortement alcalines et chargées en
polyphénols et contiennent énormément de matières
organiques qui créent une demande en oxygène
élevée.Par-dessus le marché ces eaux sont
phytotoxiques ce qui empêche un épandage agricole
à cause de radicaux phénoxy et de quinonoïdes. Or
ces composés peuvent, aussi bien réprimer le
développement d'une flore microbienne.
Des traitements physicochimiques ont été essayés
au laboratoire, mais leur valeur économique est
contestable.
Huit champignons de pourritures blanches ont été
essayés : Abortiporus biennis, Dichomitus squalens,
Inonotus hispidus,Irpex lacteus, Lentinus tigrinus,
Panellus stipticus, Pleurotus ostreatus et Trametes
hirsuta. Ce sont P.ostreatus et A.biennis qui sont les
plus efficaces jusqu'à 76% et 55% d'élimination des
polyphénols (mais après un traitement d'un mois ce
qui est considérable et gagnerait à être intensifié).
Seul P.ostreatus permet une décoloration correcte
(mais seulement de 50%). Les laccases sont les
activités les plus marquées au cours du traitement,
suivies par les peroxydases Mn-indépendantes. Ce
sont des marqueurs d'une capacité potentielle des
souches.Lignine peroxydases et vératryl alcool
oxydases sont absentes dans tous les cas. Les
peroxydases Mn-dépendantes sont, cependant,
indispensables à la décoloration, ce qui explique, en
partie, l'efficacité de P.ostreatus.
     
La Vie des Sociétés
135. La production de protéines actives par
ingénierie génétique a profité à plusieurs firmes
comme Amgen pour l'érythropoïétine et Genentech
pour la somatropine. Mais des problèmes de
production sont maintenant communs quand une
protéine a du succès. Un article discute de ces
problèmes:A Dove; Nature Biotechnology 20
(AUG02) 777-779.
Les peptides ou protéines doivent souvent être
prescrits à des doses relativement fortes pour tenir
compte des inactivations par le patient et,de plus,
certains sont utilisés pour des maladies chroniques qui
nécessitent des traitements de longues durées. Ceci
explique les accords fréquents de production avec
des firmes intermédiaires.Un récepteur soluble du
TNF d'Immunex (Enbrel™) pour traiter l'arthrite
rhumatoïde a rapidement saturé toute l'offre de
production mondiale de produits biologiques.
Et ce n'est pas le seul goulet d'étranglement en
perspective.II y a actuellement 10 anticorps
monoclonaux commercialisés et plus de 500 en
développement à des fins thérapeutiques dont au
moins 20 vont être sur le marché dans les prochaines
années.Il faudrait un doublement des capacités
globales de production pour faire face.
Or la production dans des cellules agréées comme
les CHO (Chinese Hamster Ovary) n'est pas facile à
extrapoler à de grands fermenteurs pour des
problèmes de transfert de masse et de chaleur qui ne
peuvent être résolus par une agitation trop brutale, à
cause de la sensibilité au cisaillement des cellules en
culture. Le coût de l'amplification est donc une
fonction linéaire de la capacité souhaitée. Une usine
de production dans des CHO coûte de l'ordre de 250
millions de dollars. Dans ces conditions une erreur
dans l'évaluation du marché devient vite
catastrophique. Facteur aggravant,les autorités
européennes (comme américaines) exigent que le
produit commercialisé soit manufacturé dans les
mêmes installations que celles qui ont données celui
qui a été utilisé lors des essais cliniques.Cela ne les
empêchera pas d'interdire,pour une raison ou une
autre,cette commercialisation. Les industriels devront
donc faire le pari que leur produit sera approuvé, ce
qui est incroyablement coûteux.
Ceci explique la vogue de la production dans des
animaux, œufs de poulets ou lait de mammifères,ainsi
que dans des plantes, pour lesquels la régulation
(réalisée par l'animal) et l'extrapolation (par le nombre
de producteurs ou la surface cultivée) est infiniment
plus facile.
GTC Biotherapeutics (alias Genzyme
Transgenics) et PPL Therapeutics ont lancé des
productions dans le lait de mammifères, entre autres
et Avigenics, entre autres produit dans les œufs de
poulet.Le réacteur mammaire ne peut être utilisé
dans tous les cas, car certaines protéines
recombinantes peuvent causer des dégâts dans la
glande mammaire. Par contre, la production de
protéines relativement complexes est possible dans
cette"usine"à sécréter des protéines. L'avantage est
qu'une descendance de chèvres productrices prend
18 mois par exemple, et ne suppose pas un risque
financier considérable (mais j'aimerais savoir si
27
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
l'exigence d'une reproductibilité entre essais cliniques
et production finale est respectée dans ce cas, car il
faut bien un père qui peut perturber les régulations,et
le clonage ne garantit probablement rien). La poule
est, en principe, encore plus intéressante car une poule
pond de nombreux œufs qui éclosent en 21 jours et le
temps de génération est d'environ 6 mois. Il faut
4000 poules pour produire 100 kg de protéine active
par an. Mais un détail ne doit pas être oublié: la
transformation des oiseaux est encore très en retard
sur celle des mammifères. GTC est d'ailleurs passé de
la transformation par des vecteurs rétroviraux à
d'autres vecteurs.
Dans le domaine des plantes Prodigene au Texas
qui produit les protéines dans le grain du maïs et
Meristem Therapeutics à Clermont-Ferrand
travaillants sur maïs et tabac ou CropTech
produisant dans des feuilles de tabac peuvent être
cités parmi d'autres (voir JWLarrick et al.;
Current Opinion in Biotechnology 12 (AUG01)
411-418 et le Bulletin de Novembre 2001 §27). Il
faut,cependant, savoir extraire la protéine dans
des conditions acceptables par la réglementation.
Les ennuis viennent que pour une production en
plein champ l'horizon n'est pas dégagé car les
gènes peuvent se disséminer avec le pollen alors
que pour la chèvre ou le poulet ce n'est pas une
éventualité très probable.
Il faut quand même souligner que ProdiGene, qui
produit déjà de la trypsine pour la recherche, va
produire sur 200 hectares isolés spatialement et
temporellement (en plantant ses maïs 21 jours avant
ou après les maïs environnants) et avec des machines
agricoles dédiées à cette seule production. Le succès
de cet essai devrait permettre de produire d'autres
protéines recombinantes. Le problème de la
glycosylation est, cependant, posé.
Cette question de la glycosylation divise les
scientiques et les industriels, car certains (comme
CropTech) affirment que la glycosylation est inutile
pour 70% des anticorps monoclonaux dans les
pipelines. D'autres tiennent absolument à remanier la
glycosylation imposée par la levure (avec des chaînes
de mannose qui provoquent une élimination rapide
des produits ainsi chargés). Neose se propose de venir
en aide à ces fanatiques de la glycosylation avec ses
systèmes de glycosylations enzymatiques. La
production dans des mammifères règle,en principe
ces problèmes et il se pourrait que les protéines
produites dans l'œuf soient encore meilleures.Neose
comme d'autres, se propose d'ailleurs d'améliorer les
coûts de production, voir l'efficacité de produits
tombés dans le domaine public à moindre risque (mais
les génériques sont farouchement combattus par les
détenteurs de brevets).
En oubliant la rhétorique souvent agaçante des
promoteurs des diverses techniques potentielles,il
semble bien que chacun devrait trouver un créneau où
sa technique est un peu plus concurrentielle.
     
137. On trouvera dans P Mitchell; Nature
Biotechnology 20 (AUG02) 755-756, un tour
d'horizon sur le marché boursier des sociétés de
biotechnologies.
Le Nasdaq Biotech Index a plongé de 40% au cours
du deuxième trimestre fiscal. Les profits plongent,y
compris dans le domaine pharmaceutique, et plusieurs
désillusions à propos d'autorisations de
commercialisation par la FDA (seulement trois
produits autorisés durant le semestre contre 28 durant
l'année précédente) sont venus doucher les
investisseurs,plus le procès perdu par Genentech
contre City of Hope (une sombre histoire de
dividendes non versés à hauteur de la bagatelle de 500
millions de dollars, voir le prochain Bulletin de
Décembre) ont encore aggravé la situation
psychologique des biotechnologies.
Les biotechnologies ont toujours été des
investissements à risque mais les investisseurs
comptent sur l'habileté des dirigeants des entreprises
pour limiter le risque, ce ils n'ont pas toujours été
capables.
Du côté des fusions et acquisitions on peut noter la
fusion de Rhein Biotech (Maastricht) et Berna
Biotech (Bern) et l'acquisition de Genset par Serono
en Europe et la fusion d'Amgen et Immunex
(représentant une opération de 16 milliards de dollars
sur le papier) aux Etats-Unis.
Le manque de fonds disponibles freine un peu ces
opérations d'une part, et les introductions en Bourse,
d'autre part.Ceci va avoir des conséquences
désastreuses, car 124 compagnies de biotechnologies
figurant en Bourse ont moins de deux ans de fonds
pour continuer à tourner,et 64 moins d'un an.
Comme la seule sortie de ce genre de situation (par
ailleurs assez normal dans la profession) est l'entrée en
Bourse,la situation est assez désespérée. Il est
toujours possible d'emprunter, mais beaucoup n'ont
pas encore de produit à mettre sur le marché qui
puisse garantir l'emprunt. C'est ce qui a coulé Elan.
Il y a, certes, eu des investissements durant le
dernier semestre avec environ 8 milliards de dollars.
Le capital risque a, en effet, une perspective plus large
que le détenteur moyen d'actions et les désastres
boursiers ont moins d'impact. Il a investi 884 millions
de dollars durant le dernier trimestre contre 711
pendant le trimestre précédent.
Des partenariats se sont développés comme celui
d'Aventis avec la firme s'occupant d'antisens Genta
(un investissement de 480 millions de dollar). Mais le
spectre d'Imclone,avec ses turpitudes financières,
crée un climat de suspicion sur les partenariats en
général. Les partenaires industriels vont vouloir savoir
beaucoup plus de choses de leurs partenaires. Les
futurs partenariats comporteront beaucoup moins de
paiement initial, et plus de financements associés aux
résultats. .
Beaucoup de compagnies ont une valeur boursière
qui est à peine plus que l'argent en caisse, il n'y a
donc que très peu de prime à la compétence et à la
technicité. Le cas de Lion Bioscience, dont la
capitalisation boursière actuelle est de 86 millions de
dollars alors que la société possède 122 millions de
dollars en caisse, est un cas extrême. C'est également
le cas de Human Genome Sciences.C'est usuellement
le signe que l'on a atteint le fond de l'abîme et que les
cours ne peuvent que remonter. Inch Allah!
     
28
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
139. FibroGen avance vers la commercialisation de
gélatine et de collagène recombinants dans Pichia
pastoris pour éviter l'utilisation de produits animaux
suspects de transmettre l'encéphalite spongiforme.
Pour l'instant les produits sont surtout destinés aux
usages médicaux et notamment thrombogéniques et
impliquent deux des 20 collagènes humains connus,
les types I et III. La compagnie s'associe maintenant
avec ProdiGene et Medicago Inc. pour une
production respective dans le maïs et la luzerne.
Industrial BioProcessing 24 (SEP02).
     
La Politique
140.Le 28 Mai une décision unanime de l'US
Supreme Court a renversé la décision "Festo" de la
Court of Appeals for the Federal Circuit du 29
Novembre 2000 qui avait soulevé d'énormes
controverses.Elle est discutée dans le New York
Times (29MAY02), et dans un article de AC Goris et
al.; Nature Biotechnology 20 (AUG02) 845-846.
Je rappelle que cette décision évoquée dans le
Bulletin de Juillet 2001 §189, portait sur un litige dans
le domaine de la mécanique (cas Festo contre
Shoketsu Kinzoku Kongo Kabushiki), mais on
savait déjà qu'elle aurait d'importantes conséquences
pour les biotechnologies. En effet,cette décision
reprend la notion d'équivalence (très utilisée dans les
sciences du vivant) pour dire que si la revendication
est restreinte au cours des discussions avec
l'examinateur de la demande de brevet, on ne peut
plus utiliser une équivalence (donc plus large) pour
baser une requête en infraction. La décision en
question limite donc les recours pour infraction à la
propriété industrielle basées sur l'équivalence
fonctionnelle.Or, dans le codage génétique, la
dégénérescence introduit une infinité de variantes,
par exemple. La suppression de cette protection était
grave pour les start-ups du fait de la pratique du PTO,
mise en place en Mars 2001, de publier,18 mois après
son dépôt,toute demande de brevet qui laisse
suffisamment de temps aux concurrents pour le
tourner en utilisant des modifications triviales.La
protection aurait, alors, été seulement assurée pour les
seuls éléments "littéralement"décrits.
L'origine de l'équivalence repose sur une décision
de 1852 où un fabricant de wagon pour le transport de
charbon ayant la forme d'un cône inversé et tronqué
poursuivait un autre constructeur qui utilisait une
forme octogonale tronquée avec le même effet.La
question posée est depuis de savoir où s'arrête la
protection d'un brevet,ce qui n'est vraiment pas
simple dans beaucoup de cas, et laisse la réponse à
l'appréciation de juges (et le bénéfice aux avocats).
La doctrine de l'équivalence est celle qui a été
appliquée contre l'érythropoïétine activée de
Transkaryotic Therapies et en faveur de
l'érythropoïétine d'Amgen produite dans des cellules
en culture.
Si la doctrine d'équivalence disparaissait dans le
domaine biologique, les grandes compagnies
pourraient utiliser cette voie pour rapidement répondre
à la menace d'une petite compagnie innovante.Les
redevances pour licence risqueraient, donc, d'être
sévèrement amputées, car les compagnies
pharmaceutiques (ou autres) qui acquièrent ces
licences auraient été moins assurées de la protection.
L'article de AC Goris et al. expose les raisons qui
ont entraîné le renversement de doctrine sur ce
point.
La Supreme Court a noté qu'il existe bien une
contradiction entre la flexibilité introduite par la
doctrine d'équivalence,introduisant une protection,
théoriquement très efficace, des droits des détenteurs
de brevets, et la clarté des revendications permettant
de bien connaître les limites de la protection. En 1950
la Supreme Court a confirmé cette doctrine en
soulignant, cependant, que les modifications
apportées doivent être mineures (insubstantial) pour
que l'infraction soit constatée. Les cours de justice ont,
depuis,émis des jugements variables, mais avançant
des limitations diverses à l'équivalence. L'une d'entre
elles est la "all elements rule". Chaque élément de la
revendication (ou son équivalent, bien sûr) doivent
être présent dans le produit ou le procédé accusé
d'infraction, et non plus le procédé global ou le
produit final qui n'utiliserait qu'une partie des
revendications.
Une autre limitation est la "dedication" qui porte sur
une description au sein des brevets (mais absente des
revendications) qui est considérée comme une
révélation au bénéfice du public et n'est pas couverte.
La plus importante limitation introduite est celle dite
"prosecution history estoppel" (je suis incapable de
traduire) qui empêche la réintroduction d'une
revendication abandonnée au cours de la négociation
du brevet (trop large par exemple). Mais les cours ont
souvent indiqué que la restriction des revendications
n'écarte pas forcément l'utilisation ultérieure de la
doctrine des équivalences. D'où un accroissement de
l'incertitude sur la couverture liée aux décisions de
juges ayant une connaissance limitée de l'état de l'art
dans des domaines techniques. C'est l'abandon de
cette flexibilité,et son remplacement par une règle
rigide et claire qui a été la conséquence de la
décision"Festo".
L'avantage était une base solide pour évaluer les
risques d'infraction et une meilleure prédiction de
l'issue d'un litige.Ses partisans font remarquer que
les limitations successives (en partie énumérées plus
haut) faisaient que la décision"Festo"ne compliquait
pas grand chose.
Les critiques portaient plutôt sur la rétroactivité et
l'incertitude introduite sur la propriété industrielle liée
à des brevets antérieurs, et diminuait la valeur des
futurs brevets et les redevances associées.
Les biotechnologies sont particulièrement fragiles
dans ce domaine, car il est impossible de prévoir
toutes les voies alternatives pour aboutir à un produit
ou un procédé donné et où des amendements sont
nécessaires en cours d'examen sans qu'ils soient liés à
l'état de l'art.
29
Bulletin des BioTechnologies – Octobre Novembre 2002
Un argument historique est que les cours
américaines ont constamment refusé, durant 150
ans, d'abandonner la notion d'équivalence, malgré
ses défauts.
Dans sa décision du 28 Mai,la Supreme Court a
rejeté le caractère absolu de la décision de du Federal
Circuit.Elle fait une remarque judicieuse qui consiste
à dire que face à l'incapacité intrinsèque du langage de
décrire toutes les nuances d'une invention et de définir
ses limites, il faut admettre une certaine
incertitude,au bénéfice d'une meilleure protection
des inventions déjà brevetées ou à venir. Reste à voir.
Le fait de tolérer une incertitude sur la couverture
fait que, de nouveau, ce seront les contestations
futures auprès des cours qui vont établir une
jurisprudence.Les problèmes les plus importants à
venir sont ceux des restrictions apportés en cours de
discussion du brevet et leurs relations avec le
caractère imprévisible d'une équivalence. Il y a des
problèmes à propos du caractère "imprévisible", par
qui ce caractère sera défini, à partir de quand cesse-t-il
de l'être (dépôt ou délivrance), etc…
Les conséquences pour les rédacteurs de demandes
de brevets sont un alourdissement de la recherche
pour détecter des équivalences avant le dépôt, pour en
déduire les termes utilisés. pour s'assurer que la
description littérale est suffisamment précise pour
éviter des remaniements et des restrictions de
couverture en cours de discussion avec l'office des
brevets, de prévoir dès le départ,des projets de
demandes à couvertures de diverses ampleurs, de
façon à déclencher l'une ou l'autre suivant
l'avancement de l'état de l'art. Les modifications et
restrictions en cours de discussion doivent être très
soigneusement évaluées de façon à savoir ce que l'on
abandonne réellement.
     
142. Le rapport de la National Academy of
Sciences américaine qui a été commandé en 2000 et
qui aurait dû être publié en Juin de cette année,
intitulé "Countering Agricultural Bioterrorism",est
actuellement bloqué par une controverse entre l'US
Department of Agriculture et l'Office of Homeland
Security.V Gewil; Nature 419 (12SEP02) 99. Présidé
par Harley Moon,un pathologiste animal d'Iowa State
University at Ames, le comité a effectivement achevé
sa rédaction, mais des parties du rapport qui
pourraient intéresser des bioterroristes éventuels font
problème. Des membres du comité avec les
autorisations de sécurité adéquates ont pu compulser
des documents secrets mais la déclassification doit
être obtenue avant la publication.
D'une façon générale on commence à voir des
embargos sur des publication scientifiques dites
"sensibles" dans ce domaine. Les limites n'étant pas
explicitées, on peut craindre une véritable paranoïa
digne de la période soviétique. ASM News s'en fait
l'écho dans JL Fox;ASMNews 68 (OCT02) 489-493.
La création du Department of Homeland Security, va
créer une nouvelle couche de bureaucratie, aux
attitudes imprévisibles pour l'instant.Je reviendrai sur
ce sujet dans le prochain numéro de Décembre.
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