«ΚΛΨΝΟΠΟΙΗ΢Η ΚΑΙ ΕΣΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΥΡΑ΢Η ΜΙΑ ...

nuthookransomΒιοτεχνολογία

10 Δεκ 2012 (πριν από 4 χρόνια και 6 μήνες)

441 εμφανίσεις

ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΣ΢ΟΒΙΟ ΠΟΛΤΣΕΦΝΕΙΟ

΢ΦΟΛΗ ΦΗΜΙΚΨΝ ΜΗΦΑΝΙΚΨΝ

ΣΟΜΕΑ΢
IV
: ΢ΤΝΘΕ΢Η΢ & ΑΝΑΠΣΤΞΗ΢ ΒΙΟΜΗΦΑΝΙΚΨΝ
ΔΙΑΔΙΚΑ΢ΙΨΝ

ΕΡΓΑ΢ΣΗΡΙΟ ΒΙΟΣΕΦΝΟΛΟΓΙΑ΢












«
ΚΛΨΝΟΠΟΙΗ΢Η ΚΑΙ ΕΣΕΡΟΛΟΓΗ ΕΚΥΡΑ΢Η ΜΙΑ΢
ΚΕΛΛΟΒΙΟΫΔΡΟΛΑ΢Η΢ ΣΗ΢ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ΢
GH
7 ΣΟΤ
ΘΕΡΜΟΥΙΛΟΤ ΜΤΚΗΣΑ

Sporotrichum

thermophile
»










ΔΙΠΛΨΜΑΣΙΚΗ ΕΡΓΑ΢ΙΑ


ΛΟΣ΢Η ΕΛΙ
΢ΑΒΕΣ










ΕΠΙΒΛΕΠΨΝ ΚΑΘΗΓΗΣΗ΢

Π. ΦΡΙ΢ΣΑΚΟΠΟΤΛΟ΢









ΑΘΗΝΑ, 2011


2











Στην οικογένειά μου













































3




ΠΡΟΛΟΓΟ΢


Η παροϑςα διπλ
ωματικό εργαςύα
εκπονόθηκε ςτο Ε
ργα
ςτόριο Βιοτεχνολογύασ

του Σομϋα ΢ϑνθεςησ και Ανϊπτυξησ Βιομηχανικϔν Διεργαςιϔν του τμόματοσ Φημικϔν
Μηχανικϔν του Εθνικοϑ Μετςϐβιου Πολυτεχνεύου.

Καθοριςτικόσ ςημαςύασ για τη
διεκπεραύωςη

τησ
δ
ιπλωματικόσ εργαςύασ υπόρξε
η ςυμβολό ϐλων τ
ων μελϔν τησ ομϊδασ του εργαςτηρύου.

Θερμϋσ ευχαριςτύεσ, θα όθελα να εκφρϊςω προσ τον Αν. Καθηγητό κ. Παϑλο
Φριςτακϐπουλο για την εμπιςτοςϑνη που μου επϋδειξε κατϊ την ανϊθεςη τησ
διπλωματικόσ εργαςύασ
, καθϔσ και για την ευ
καιρύα που μου παρεύχε για μεθοδι
κό και
ςυςτηματικό εναςχϐληςη με θϋματα που ϊπτονται του γνωςτικοϑ αντικειμϋνου τησ
β
ιοτεχνολογύασ. Ιδιαύτερεσ ευχαρι
ςτύεσ θα όθελα να απε
υθϑνω ςτον Λϋκτορα

κ.
Ευϊγγελο Σϐπακα για την ϊρτια και πολϑπλευρη επιςτημονικό
του
καθοδόγηςη, η οπούα
ϋδραςε καταλυτ
ικϊ ςτην αφομούωςη των βαςικϔν αρχϔν τησ
β
ιοτεχνολογύασ καθϔσ και
ςτην υλοπούηςη τησ ε
ρ
γαςύασ.

Θερμϋσ ευχαρι
ςτύεσ οφεύλω να εκφρϊςω ςτην υποψόφια διδϊκτορα Ανθό
Καρναοϑρη για την πολϑτιμη καθοδόγηςό τησ κατϊ τη διεξαγωγό των πειραμϊτων.
Καθοριςτικό υπόρξε
η βοόθειϊ τησ κατϊ την μϑηςη μου ςτην εν γϋνει οργϊνωςη και
λειτουργύα ενϐσ εργαςτηρύου, καθϔσ και ςτην υπερνύκηςη ποικύλων ζητημϊτων και
δυςκολιϔν τεχνικοϑ χαρακτόρα που ανϋκυψαν κατϊ την πειραματικό διαδικαςύα.

Πολλϋσ ευχαρι
ςτύεσ εκφρϊζονται ςε ϐλα τα μϋ
λη του εργαςτόριου τϐςο για τη
ςτόριξη και τη βοόθειϊ τουσ, ϐςο και για την ϊριςτη και υποδειγματικό
ςτϊςη που
επϋδειξαν καθ΄ ϐλη τη διϊρκεια τησ
ςυνεργαςύα μασ.







Λ
ϐ
τςη Ελι
ςϊβετ

Αθόνα, 2011




4




ΠΕΡΙΛΗΨΗ


Η παροϑςα διπλωματικό εργαςύα εύχε ωσ αντικεύμενο την κλωνοπούηςη και την
ετερϐλογη ϋκφραςη ενϐσ γονιδύου του θερμϐφιλου κυτταρινολυτικοϑ μϑκητα
Sporotrichum

thermophile

το οπούο κωδικοποιεύ μια πρωτεϏνη με ενεργϐτητα
κελλοβιοϒδρολϊςησ (ϋξω
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκαν
ϊςησ) [
EC

3.2.1.91] τησ οικογϋνειασ 7 τησ
ευρϑτερησ ομϊδασ των γλυκοςιδαςϔν. Η νουκλεοτιδικό αλληλουχύα του γονιδύου
αναςϑρθηκε απϐ τη βϊςη δεδομϋνων
Genome

Portal

ϐπου κατατύθεται το γονιδύωμα του
S
.
thermophile
. Αρχικϊ, πραγματοποιόθηκε διαδικαςύα απομϐν
ωςησ του ολικοϑ
DNA

του
S
.
thermophile

και ακολοϑθηςε η
in

vitro

ποςοτικό ενύςχυςη τησ νουκλεοτιδικόσ
αλληλουχύασ του γονιδύου απϐ το δεύγμα γονιδιωματικοϑ
DNA

με τη μϋθοδο τησ
αλυςιδωτόσ αντύδραςησ πολυμερϊςησ. Η ϋνθεςη τησ νουκλεοτιδικόσ αλληλουχύασ ςτον
πλαςμιδιακϐ φορϋα κλωνοπούηςησ
pCR
®

Blunt

πραγματοποιόθηκε μϋςω αντύδραςησ
ςυνϋνωςησ κ
αι επακολοϑθηςε ο μεταςχηματιςμϐ
σ επιδεκτικϔν βακτηριακϔν κυττϊρων
E
.
co
li
. Η μϋθοδοσ τησ αλυςιδωτόσ αντύδραςησ πολυμερϊςησ επικϊλυψησ/επϋκταςησ
χρηςιμοποιόθηκε για την
ενύςχυςη των δϑο κωδικοποιουςϔν

περιοχϔν του γονιδύου
(εξϔνια) και την παραγωγό τμημϊτων
DNA

που αποτελοϑνταν απϐ την ςυνϋνωςη των
δϑο περιοχϔν. Σα προώϐντα ει
ςόχθηςαν ςτον φορϋα
pCR
®

Blunt

προσ μεταςχηματιςμϐ
κυττϊρων του βακτηρύου
E
.
coli
. Η αλληλουχύα απομονϔθηκε και ειςόχθη ςτον
πλαςμιδιακϐ φορϋα
pPICZ
α
C

και τα αναςυνδυαςμϋνα πλαςμύδια χρηςιμοποιόθηκαν για
το μεταςχηματιςμϐ ςτελεχϔν
E
.
coli
. Κατϐπιν απομϐνως
ησ και γραμμικοπο
ύηςησ του
αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύ
ου, πραγματοποιόθηκε διαδικαςύα μεταςχηματιςμοϑ
ευκαρυωτικϔ
ν κυττϊρων του μεθυλϐτροφου ζυμο
μϑκητα
Pichia

pastoris

με
ηλεκτροδιϊτρηςη. Η ϋκφραςη τησ ετερϐλογησ αλληλουχύασ απϐ τα μεταςχηματιςμϋνα
ςτελϋχη
Pi
chia

pastoris

μελετόθηκε ςε καλλιϋργειεσ μικρόσ κλύμακασ. Η μελϋτη κατϋδειξε
ικανοποιητικϊ επύπεδα ανϊπτυξησ τησ βιομϊζασ, ενϔ δεν ανιχνεϑθηκε ενεργϐτητα του
ενζϑμου ςε ειδικϋσ δοκιμϋσ με υποςτρϔματα μικροκρυςταλλικόσ κυτταρύνησ και
υποκατεςτημϋνου πυρανοζ
ύτη
pNPC

(
p
-
n
itrophenyl
-
β
-
D
-
cellobioside
). Εντοϑτοισ, η
μελϋτη ςυνεχύςτηκε με την παραγωγό τησ αναςυνδυ
αςμϋνησ
πρωτεϏνησ

ςε καλλιϋργειε
σ
μεγϊλησ κλύμακασ με ςκοπϐ την ανϊκτηςη και τον καθαριςμϐ τησ πρωτεϏνησ απϐ το
υπερκεύμενο υγρϐ των καλλιεργειϔν. Σο μοριακϐ βϊροσ τησ απομονωθεύςασ πρωτεϏνησ
προςδιορύςτηκε ςτα
57
kDa

κατϐπιν ηλεκτροφϐρηςησ ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου.
Η τιμό αυτό βρύςκε
ται ςε ςυμφωνύα με την θεωρητικϊ υπολογιζϐμενη τιμό, ϐπωσ αυτό
εκτιμόθηκε με τη βοόθεια του υπολογιςτικοϑ αλγορύθμου
ProtParam
. Κατϊ τον
ηλεκτροφορητικϐ διαχωριςμϐ, εμφανύςτηκαν περιςςϐτερεσ απϐ μια ζϔνεσ οι οπούεσ
υποδεικνϑουν μερικό πρωτεϐλυςη τησ αναςυν
δυαςμϋνησ πρωτεϏνησ.
Η καθαρό
πρωτεϏνη

παρουςιϊζει χαμηλό ειδικό ενεργϐτητα
(0.02
U
/
mg
)
ςε υπϐςτρωμα
μικροκρυςταλλικόσ κυτταρύνησ 2%
w
/
v
.
Σϋλοσ, ϋγινε μοντελοπούηςη τησ τριςδιϊςτατησ
δομόσ τησ πρωτεϏνησ με το υπολογιςτικϐ πρϐγραμμα
SWISS
-
MODEL
. Απϐ τη μελϋ
τη αυτό
προϋκυψε μια διαμϐρφωςη τυπικό για τα ϋνζυμα τησ οικογϋνειασ 7. Εντοϑτοισ, η
ςταθεροπούηςη τησ δομόσ περιλαμβϊνει το ςχηματιςμϐ αρκετϔν διςουλφιδικϔν
γεφυρϔν. ΢ϑμφωνα με τη βιβλιογραφύα, υπϊρχουν παραδεύγματα μη ςωςτοϑ
ςχηματιςμοϑ διςουλφιδικϔν δες
μϔν απϐ το ετερϐλογο ςϑςτημα ϋκφραςησ
Pichia

pastoris
,
γεγονϐσ που μπορεύ να ςυνδϋεται με την ϋλλειψη ενζυμικόσ ενεργϐτητασ ενϔ
ςυγχρϐνωσ διαμορφϔνει τη βϊςη για περεταύρω μελϋτη.





5




ABSTRACT


The present thesis focuses
on cloning and heterologous expression of a gene from the
thermophilic cellulolytic fungus
Sporotrichum thermophile

encoding a glycosyl hydrolase
family 7 protein exhibiting cellobiohydrolase (exo
-
1,4
-
β
-
D
-
glucanase) [EC 3.2.1.91]
activity. The nucleotide s
equence of the gene was recovered from the
Genome Portal
database, where the
S. thermophile

genome is deposited. At first, a procedure for isolation
of total DNA
from
S. thermophile

was performed and followed by the in vitro quantitative
amplification of t
he gene from the genomic DNA sample using polymerase chain reaction.
The nucleotide sequence was inserted into the plasmid cloning vector pCR
®

Blunt via a
ligation reaction and transformation of competent bacterial cells
E. coli

followed. The
overlap extension polymerase chain reaction method was used to amplify the two coding
regions of the gene (exons) and produce DNA fragments consisting of the two reg
ions
spliced together. The prod
ucts were inserted into the pCR
®

Blunt vector

in order to
transform cells of the bacterium
E. coli
. The DNA sequence was isolated and inserted into
the plasmid vector pPICZαC and the recombinant plasmids were used to transform
E.coli
strains. After the isolation and the linearization of the recombina
nt plasmid, a procedure
for transformation of eukaryotic cells of the methylotrophic yeast
Pichia pastoris

by
electroporation was performed. The expression of the heterologous sequence in the
modified strains was studied in small scale cultures. The study
showed satisfactory levels
of biomass growth, while no enzyme activity was detected when the enzyme was assayed
in the presence of microcrystalline cellulose and substituted pyranoside pNPC

(
p
-
n
itrophenyl
-
β
-
D
-
cellobioside
)

substrates. Nevertheless, the study continued with the
production
of the recombinant protein in large scale cultures in order to recover and
purify the protein from the cultures supernatant. The molecular weight of the isolated
protein was determined to
57
kDa after SDS
-
PAGE. This value is found to be in agreement
with t
he theoretically calculated value, as estimated from the computational algorithm
ProtParam. After the electrophoretic separation, more than one bands occurred
indicating partial proteolysis of the recombinant protein.
The purified enzyme showed
low specifi
c activity (0.02 U/mg) towards microcrystalline cellulose 2% w/v.
Finally, a
model of the three
-
dimensional structure of the protein was build using the computer
program SWISS
-
MODEL. From this study arose a protein conformation which is typical
for the fam
ily 7 enzymes. However, the stabilization of the structure comprises several
disulfide bridges. According to the literature, there are examples of improper disulfide
bonds formation by the heterologous expression system
Pichia pastoris
, a fact that might
b
e associated with the lack of enzymatic activity while forms the base for further study.





6


ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ




ΠΡΟ
ΛΟΓΟ΢
…………………………………………………………………………………………………………
...

……
3

Π
ΕΡΙΛΗΧΗ
………………………………
…………………………………………………………………

……...

……
4

A
BSTRACT
…………………………………
………………………………………………………………


……

……
5

Κ
ΑΣΑΛΟΓΟ΢
ΠΙΝΑΚΨΝ
…………………………
…………………………………………………………

...

……
9

Κ
ΑΣΑΛΟΓΟ΢
΢ΦΗΜΑΣΨΝ
…………
……
…………………………………
………………………

…...
..
.
......

….
11


Κεφϊλαιο 1
. Η φυτικό βιομϊζα ωσ πρώτη ϑλη για την παραγωγό βιοκαυςύμων
.
.
1
8

1.1.

Παραγωγό βιοαιθανϐλησ
απϐ βιομϊζα λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ
……
.
.

….
18

1.2.

Κϑρια ςυςτατικϊ λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ
…………………………………
……

….
20

1.2.1

Κυτταρύνη
………
………………………………………………………………………
...
........

….
20

1.2.2

Ημικυτταρύνη
………
……………………………
………………………………………...
..
...

….
22



1.2.2.1

Ξυλϊνη
.
……
……………
…………………………………………………………
….

….
23

1.2.3

Λιγνύνη
……………
………………………………………………………………………
..
……
.

….
23

1.3

Δομό και ςϑςταςη
του
κυτταρικοϑ τοιχϔματο
σ των φυτικϔν κυττϊρων…

..

….
25


Κεφϊλαιο 2
. Ενζυμικό υδρϐλυςη λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ
…………………

….
26

2.1

Ενζυμικό υδρϐλυςη κυτταρύνησ
………………………………………………………………

..

….
26


2.1.1

Θϋςη κυτταριναςϔν ςτο ταξινομικϐ ςχόμα των ενζϑμων......
............
...
..
...

….
28


2.1.2

Μοριακό δομό κυττ
αριναςϔν…………………………………………………
……….

….
28


2.1.3

Καταλυτικϐσ μηχανιςμϐσ

κυτταριναςϔν………
…………………………
………

….
31


2.1.4

Κυτταρινολυτικϐ ςϑςτημα β
ακτηρύων και μυκότων……………………

...
….
32


2.1.5

Έξω
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςεσ

ό κελλο
βιοϒδρολϊςεσ
…………………………


….
33


2.1.6

Βιομηχανικϋσ εφαρμογϋσ
κυτταριναςϔν………………………………………


….
35

2.2

Ενζυμικό υδρϐλυςη ημικυτταρύν
ησ………………………………………………………


..

….
36

2.3

Ενζυμικό υδρϐλυςη λιγνύνησ……
……………………………………………………………
…….

….
38


Κεφϊλαιο 3. Ο κυτταρινολυτικϐσ μϑκητασ
Sporotrichum

thermophile
…………
….

….
39

3.1

Ο

κυτταρινολυτικϐσ

μϑκητασ

Sporotrichum

thermophile
……………………………
..

….
39


Κεφϊλαιο

4.
Ο

ζυμο
μϑκητασ

Pichia

pastoris

ωσ

ετερϐλογο

ςϑςτημα

ϋκφραςησ


πρωτεώνών
…………
…………………………………………
……………………………

...

….
42

4.1

Γενικϊ χαρακτηριςτικϊ του ζυμομϑκητα
Pichia

pastori
s
...................
........................

….
42

4.2

Ο
υποκινητόσ ΑΟΦ1 ελϋγχει την ϋκφραςη των

αναςυνδυαςμϋνων πρωτεώνϔν.
..
45

4.3

Έκκριςη και μετα
-
μεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ ςτη ζϑμη
Pichia

pastoris

.

….
46


΢κοπϐσ τησ εργαςύασ
……………………
…………………………………………………………
…………
..
…..47


Κεφϊλαιο 5. Τλικϊ και Μϋθοδοι
………………………………………………………………………

.

….
48

5.1

Τλικϊ………………………………
……………………………………………………………………
……

….
48

5.1.1

΢υςκευϋσ
-
Όργαν
α……………………………………………………………………
…...
...

….
48

5.1.2

Φημικϊ αντιδραςτόρια........................................................................
........
.............
.
.

….
49


5.1.3

Διαλϑ
ματα…………
………………………………………………………………………
…..
.

….
49


5.1.4

Τλικϊ χρωματογραφ
ύασ………………………………………………………………
….

….
50


5.1.5

Συποποιημϋνα εμπορικϊ παραςκευϊςμ
ατα……………………………………
.

….
50


5.1.6

Μικροοργανιςμού, θρεπτικϊ μϋςα
και ςυνθόκεσ
καλλιϋργειασ…………
.

….
50



5.1.6.1

΢τελϋχη μικροο
ργανιςμϔν……………………………………………
……
..

….
50



5.1.6.2

Θρεπτικϊ μϋςα ανϊπ
τυξησ μικροοργανιςμϔν………………

……

….
51



5.1.6.3

΢υνθόκεσ καλλιϋργειασ…………………………………
……………
……
….

….
52


5.1.7

Πλαςμιδιακού φορεύσ κλωνοπ
ούηςησ και ϋκφρας
ησ……………………
……

….
53


7




5.1.7.1

Π
λαςμιδιακϐσ φορϋασ κλωνοπούηςησ
pCR
®

Blunt
……......
.............
.
...
53



5.1.7.2

Π
λαςμιδιακϐσ φορϋασ κλωνοπούηςησ και ϋκφραςησ
pPICZ
α
...

...
..
54


5.1.8

΢υνθετικϊ ολιγονουκλεοτύδια εκκινητϋσ………………………
………………

.

….
55

5.2

Μϋθοδοι……………………………
…………………………………………………………………
……..

….
55


5.2.1

Απομϐνωςη ολικοϑ
DNA

απϐ το μϑκητα
S
.
thermophile
………………
……

….
55


5.2.2

Ηλεκτροφϐρηςη
DNA

ςε πόκτωμα αγαρϐζησ
……………………………
……
..

….
55


5.2.3

Απομϐνωςη
DNA

απϐ πόκτωμα αγαρϐζησ
………………………………
……...
..

….
56

5.2.4

Αλυςιδωτό αντύδραςη πολυμερϊςησ (
Polymerase

Chain

Reaction
,
PCR
)
……………
……………………………………………………………………………
……
.

….
56

5.2.5

Αλυςιδωτό α
ντύδραςη πολυμερϊςησ επικϊλυψησ/
επϋκταςησ (
Overlap

extension

polymerase

chain

reaction
,
OE
-
PCR
)
…………………………
……
...

….
58


5.2.6

Αντύδραςη ςυνϋνωςησ μορύων
DNA

(
ligation
)
………………
……………
……
.

….
60


5.2.7

Πϋψη
DNA

με ενδονουκλεϊςεσ περιοριςμοϑ
………………………………
……
.

….
61


5.2.8

Απομϐνωςη πλαςμιδιακοϑ
DNA
…………………………………………………



….
62


5.2.9

Προςδιοριςμϐσ νουκλεοτιδικόσ αλληλουχύασ
DNA
……………………
…….
..

….
63

5.2.10

Προετοιμαςύα επιδεκτικϔν κυττϊρων βακτηρύων
E
.

coli

με τη χρόςη
χλωριοϑχου αςβεςτύου
……………………………………………………………
……
...

….
63


5.2.11

Μεταςχη
ματιςμϐσ επιδεκτικϔν

κυττϊ
ρων
βακτηρύων
E
.

coli
………
……

….
63


5.2.12

Προετοιμαςύα επιδεκτικϔν

κυττϊρων
ζϑμησ
P
.

pastoris
……………………

….
64


5.2.13

Μεταςχηματιςμϐσ επιδεκτικϔν κυττϊρων
ζϑμησ
P
.

pastoris
……
………
..

….
64

5.
2.14

Έκφραςη αναςυνδυαςμϋνων πρωτεώνϔν

ςε καλλιϋργειεσ μικρόσ
κλύμακασ
…………
………………………………………………………………………
……
...

….
65

5.2.15

Έκφραςη αναςυνδυαςμϋνων πρωτεώνϔν

ςε καλλιϋργειεσ μεγϊλησ
κλύμακασ
……………
…………………………………………………………………
………
...

….
65


5.2.16

Ανϊκτηςη και καθαριςμϐσ αναςυνδυαςμϋνων πρωτεώνϔν
…………
……
.

….
65

5.2.
1.16.1

Υυγοκϋντρηςη, διόθηςη
,

ςυμπϑκνωςη

και εξιςορρϐπηςη
υπερκειμϋνου καλλιϋργειασ…………………………………

..

….
65

5.2.16.2

Απομϐνωςη αναςυνδυαςμϋνων πρωτεώνϔν με
Φρωματογραφύα ΢υγγενεύασ Ακινητοποιημϋνου Μετϊλλου
(
Immobilized

Metal

Affinity

Chromatography
,
IMAC
)
………………………………………………………………
……
...

….
66


5.2.17

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πηκτό πολυακρυλαμύδησ
-
SDS

(
SDS
-
PAGE
)
……

..

….
67


5.2.18

Ποςοτικϐσ προςδιοριςμϐσ πρωτεώνϔν
……………………………………

…….

….
69

5.2.18.1

Ποςοτικϐσ προςδιοριςμϐσ πρωτεώνϔν με τη
χρωματομετρικό μϋθοδο
Bradford
………………………

...

….
69

5.2.18.2

Ποςοτικϐσ προςδιοριςμϐσ πρωτεώνϔν με
φαςματοςκοπικό μϋθοδο
………………………………………
...

….
69

5.2.19

Ανύχνευςη ενζυμ
ικόσ ενεργϐτητασ εξωγλουκανϊςησ
(κελλοβιοϒδρολϊςησ)

........................................................................
........................

….
69

5.2.19.1

Ανύχνευςη ενεργϐτητασ εξωγλουκανϊςησ ςε υπϐςτρωμα
μικροκρυςταλλικόσ κυτ
ταρύνησ (
Avicel
)
…………………
..

….
69

5.2.19.2

Ανύχνευςη ενεργϐτητασ εξωγλουκανϊςησ ςε υπϐςτρωμα
pNPC

(
p
-
n
itrophenyl
-
β
-
D
-
cellobioside
)
……………………
.

….
70


Κεφϊλαιο 6. Αποτελϋςματα

…………………………………………………………………………
…..
.

….
71

6.1

Σο

γονύδιο

StCBH
7
του

θερμϐφιλου

μϑκητα

Sporotrichum

thermophile

……
...

….
71

6.2

Απομϐνωςη και ενύςχυςη του γονιδύου
StCBH
7 του
Sporotrichum

thermophile
……………………
…………………………………………………………………………
.

….
73

6.3

Ένθεςη του γονιδύου ςτον πλαςμιδιακϐ φορϋα κλωνοπούηςησ
pCR
®

Blunt

και
μεταςχηματιςμϐσ βακτηριακϔν κυττϊρων
E
.
coli
………………………………………
..

….
78

6.4

Ένθεςη του γονιδύου ςτον πλαςμιδιακϐ φορϋα κλωνοπούηςησ
pPICZ
α
C

και
μεταςχηματιςμϐσ βακτηριακϔν κυττϊρων
E
.
col
i
…………………………
……………
...

….
80


8


6.5

Ένθεςη του γονιδύου ςτον πλαςμιδιακϐ φορϋα κλωνοπούηςησ
pPICZ
α
C

και
μεταςχηματιςμϐσ ευκαρυωτικϔν κυττϊρων
Pichia

pastoris
……………………

...

….
81

6.6

Έκφραςη του γονιδύου
StCBH

ςε καλλιϋργειεσ μικρόσ κλύμακασ
…………………
..

….
83

6.7

Έκφραςη του γονιδύου
StCBH

ςε καλλιϋ
ργειεσ μεγϊλησ κλύμακασ και απομϐνωςη
τησ αναςυνδυαςμϋνησ πρωτεϏνησ
………………………………………………………………
.

….
85

6.8

Καταςκευό μοντϋλου αναπαρϊςταςησ τησ τριςδιϊςτατησ δομόσ τησ
αναςυνδυαςμϋνησ πρωτεϏνησ
……………………………………………………………………
..

….
87


Κεφϊλαιο 7.
΢υμπερϊςματα
-
Μελλοντικϋσ προοπτικϋσ
……………………………
………..

….
89


Βιβλιογραφία
……………………………
…………………………………………………………………
……….

….
93













































9




ΚΑΣΑΛΟΓΟ΢ ΠΙΝΑΚΩΝ




Πίνακας 1.1.

Σα χαρακτηριςτικϊ των πϋντε οικογενειϔν ξυλανϔν [
Saha
,
2003]
………………………………………………………………………………

.

….
24


Πίνακας 2.1.

Υυςικοχημικϋσ ιδιϐτητεσ κελλοβιοϒδρολαςϔν απϐ διϊφορουσ
μικ
ρ
οοργανιςμοϑσ
……………………………………………………………
...

….
35


Πίνακας 3.1.

΢υνϔνυμα και ςυςτηματικό ταξινϐμηςη
Sporotrichum

thermophile

[
NCBI
]
…………………………………………………
…………
...

….
41


Πίνακας 4.1.


΢υνϔνυμα και ςυςτηματικό ταξινϐμηςη
Pichia

pastoris

[
NCBI
]

…………
………………………………………………………………………
………...
….
44


Πίνακας 5.1.

Αλληλουχύα, μοριακϐ βϊρο
σ
,
MW
,

κ
αι θερμοκραςύα τόξησ
,
T
m
,

των
ςυνθετικϔν ολιγονο
υ
κλεοτιδύων που χρηςιμοποιόθηκαν ωσ
εναρκτόρια μϐρια για την ενύςχυςη του γονιδύου
StCBH
7 του
Sporotrichum

thermophile
…………………………………………………


….
56


Πίνακας 5.2.

΢υςτατικϊ του μύγματοσ αντύδραςησ για την ενύςχυςη τησ
αλληλουχύασ
-
ςτϐχου με
PCR
…………………………………………
……
..

….
59


Πίνακας 5.3.

΢υνθόκεσ αντύδραςησ για την ενύςχυςη μιασ αλληλουχύασ
-
ςτϐχου
με
PCR

ανϊλογα με το μόκοσ τησ αλληλουχύασ
-
ςτϐχου
……………
…………………………………………………………
………
..

….
59


Πίνακας 5.4.

΢υςτατικϊ που ειςϊγονται ςτο μύγμα αντύδραςησ για την
ενύςχυςη τησ αλληλ
ουχύασ
-
ςτϐχο με
PCR
……………………
………
..

….
60


Πίνακας 5.5.


΢υςτατικϊ του μύγματοσ αντύδραςησ ςτην
OE
-
PCR
………
………

….
61


Πίνακας 5.6
.

΢υςτατικϊ αντύδραςησ για τη ςυνϋνωςη τμόματοσ
DNA

ςτο
πλαςμύδιο
pCR
®

Blunt
………………………………………………………

.

….
61


Πίνακας 5.7.

΢υςτατικϊ αντιδρϊςεων ςυνϋνωςησ τμημϊτων
DNA

ςτον
πλαςμιδιακϐ φορϋα
pPICZ
α
C
…………………………………………
……

….
62


Πίνακας 5.8.

Περιοριςτικϋσ ενδονουκλεϊςεσ, μικροοργανιςμού προϋλευςησ,
αλληλουχύεσ αναγνϔριςησ και θϋςεισ πϋψεισ
……………………

..

….
62


Πίνακας 5.9.

΢υςτατικϊ αντύδραςησ πϋψησ πλαςμιδιακοϑ
DNA

απϐ τα
περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και
XbaI
…………………………………
……
..

….
63


Πίνακας 5.10.

΢υςτατικϊ αντύδραςησ πϋψησ αναςυνδυαςμϋνων πλαςμιδύων
pCR
®

Blunt

απϐ τα περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και
XbaI
……


..

….
63


Πίνακας 5.11.

΢υςτατικϊ αντύδραςησ πϋψησ με το περιοριςτικϐ ϋνζυμο
PmeI

για
τη γραμμικοπούηςη του αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύου
pPICZaC
………………………………………………………
………………

.

..

….
63


10



Πίνακας 5.12.

Αναλογύεσ ςυςτατικϔν για την παραςκευό πηκτ
ϔματοσ
επιςτούβαξησ 4% Σ και πη
κτϔματοσ
διαχωριςμοϑ 10% Σ


.

….
69


Πίνακας 5.13.

Πρϐτυπο διϊλυμα πρωτεώνϔν γνωςτοϑ μοριακοϑ βϊρουσ για τον
προςδιοριςμϐ του μοριακοϑ βϊρουσ των ϊγνωςτων διαλυμϊτων
πρωτεώνϔν (
Unstained

Protein

Molecular

Weight

Marker
,
Fermentas
)
……………………………………………………………
……
………

….
69


Π
ίνακας
6.1
.

Ποςοςτ
ϊ ομοιϐ
τητασ τησ αμινοξικόσ αλληλουχύασ τησ
πρωτεϏνησ

που κωδικοποιεύται απϐ το γονύδιο
StCBH

του
Sporotrichum

thermophile

με χαρακτηριςμϋνεσ κελλοβιοϒδρολϊςεσ, ϐπωσ
προκϑπτει μετϊ απϐ ςτούχιςη με τον υπολογιςτικοϑ αλγϐριθμο
BLAST

[Altschul
et
.

al
., 1990]

..…
……
……………
....................................
72


Πίνακας
6.2
.

Φαρακτηριςτικϊ του γονιδύου
StCBH
7 του
Sporotrichum

thermophile

…………………………………………………………………
..
....
.

….
74


Πίνακας
6.3
.

Αποτελϋςματα των υπολογιςτικϔν εργαλεύων
SignalP

[
Bendtsen

et

al
., 2004],
Pfam

[
Finn

et

al
., 2009],
NetNGlyc

[
Gupta

et

al
.,2004],
NetOGlyc

[
Julenius

et

al
.
, 2005], και
ProtParam

[
Wilkins

et

al
.,
1999] για τον προςδιοριςμϐ κατ’ αντιςτοιχύα, τησ ςηματοδοτικόσ
αλληλουχύασ ϋκκριςησ, των αυτοτελϔν δομικϔν περιοχϔν, των
περιοχϔν Ν
-

και Ο
-
γλυκοζυλύωςησ, και του θεωρητικοϑ μοριακοϑ
βϊρουσ και ιςοηλεκτρικοϑ ςημεύου τησ πρωτεϏνησ που
κωδικοποιεύται απϐ τ
ο γονύδιο
StCBH
7
……

………………………
..

….
74


Πίνακας
6.4
.

Ποςοςτϊ ομοιϐτητασ τησ αμινοξικόσ αλληλουχύασ τησ πρωτεϏνησ
που κωδικοποιεύται απϐ το γονύδιο
StCBH

του
Sporotrichum

thermophile

με κελλοβιοϒδρολϊςεσ των οπούων οι δομϋσ ϋχουν
προςδιοριςτεύ κρυςταλλογραφικϊ, ϐπωσ προκϑπτει μετϊ απϐ
ςτούχιςη με τον υπολογιςτικοϑ αλγϐριθμο
BLAST
[Altschul
et al
.,
1990]
…………………………………………………………………
………
………
.

….
88























11




ΚΑΣΑΛΟΓΟ΢ ΢ΧΗΜΑΣΩΝ




Σχήμα 1.1.

Συπικϐ διϊγραμμα ροόσ διεργαςύασ παραγωγόσ βιοαιθανϐλησ απϐ
βιομϊζα λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ. Απεικονύζονται τα
βαςικϊ ςτϊδια ςτα οπούα ςυντελεύται η διεργαςύα. Η υδρϐλυςη
τησ λιγνινοκυτταρινοϑχου φυτικό ϑλησ μπορεύ να
πραγματοποιηθεύ με τη

χρόςη χημικϔν ό ενζυμικϔν υδρολυτικϔν
μϋςων.
Όταν η ςακχαροπούηςη τησ βιομϊζασ πραγματοποιεύται με
ενζυμικό υδρϐλυςη, κρύνεται απαραύτητο ϋνα επιπρϐςθετο ςτϊδιο
προκατεργαςύασ μϋςω φυςικϔν, χημικϔν, βιολογικϔν ό
ςυνδυαςμϋνων
μεθϐδων. Η

προκατεργαςύα ςτοχε
ϑει ςτη
διϊςπαςη τησ περύπλοκησ δομόσ του λιγνινοκυτταρ
ινοϑχου
υλικοϑ και ςτην κλαςμϊτω
ςη τησ βιομϊζασ με απομϊκρυνςη τησ
ημικυτταρύνησ και τησ λιγνύνησ, καθϔσ και ςτην αϑξηςη τησ
επιδεκτικϐτητασ του υποςτρϔματοσ ςε προςβολό απϐ το
υδρολυτικϐ μϋςο, με αϑξη
ςη τησ επιφϊνειασ
επαφόσ [
Szczodrak

&
Fiedurek
, 1996
;
Sun

&
Cheng
, 2002
]…
…………………………………
.

….
20


Σχήμα 1.2.

Μοριακό δομό τησ κυτταρύνησ, ϋνα 1,4
-
Ο
-

-
D
-
γλυκοπυρανοζιτικϐ) πολυμερϋσ. Εντϐσ των αγκυλϔν
απεικονύζεται η επαναλαμβανϐμενη δομικό μονϊδα του
μακρομορύου, ο διςακχαρύτησ κελλοβιϐζη, ενϔ με
n

υποδηλϔνεται
ο αριθμϐσ των δομικϔν μονϊδων ανϊ αλυςύδα. Επύςησ,
επιςημαύνεται το αναγωγικϐ ϊκρο τησ αλυςύδα
σ [
Perez

&
Samain
,
2010
]…………………………………………………………
…………………

….

….
21


Σχήμα 1.3.

Οι δεςμού υδρογϐνου που αναπτϑςςονται μεταξϑ μορύων
γλυκϐζησ τησ ύδιασ αλυςύδασ καθϔσ και μεταξϑ μορύων γλυκϐζησ
που ανόκουν ςε διαφορετικϋσ αλυςύδεσ κυτταρύνησ διευθετοϑν
τισ αλυςύδ
εσ ςε παρϊλληλη επύπεδη διϊταξη προκαλϔντασ
ταυτϐχρονα το ςχηματιςμϐ υδρογονικϔν δεςμϔν μεταξϑ των
παρϊλληλων επιπϋδων κυτταρύνησ. Σο εκτεταμϋνο αυτϐ δύκτυο
υδρογονικϔν δεςμϔν ϋχει ωσ αποτϋλεςμα τη δημιουργύα
ςυμπαγϔν και δϑςκολα αποικοδομόςιμων κρυςταλλικ
ϔν
περιοχϔν. [
Liu

&
Sun
, 2010]………………………………………
…….

..

….
22


Σχήμα 1.4.

Οργϊνωςη τησ κυτταρύνησ ςε δομϋσ αυξανϐμενησ
πολυπλοκϐτητασ, απϐ το μϐριο ϋωσ το κυτταρικϐ τούχωμα.
[
Roberts
, 1996
]………………………………………………………
…...

……

….
22


Σχήμα1.5.


΢τοιχειϔδησ κυψελύδα τησ κυτταρύνησ
I
α

και τησ κυτταρύνησ
I
β
….
23


Σχήμα 1.6.

Σα μονομερό, (α)
p
-
κουμαρυλο
-
, (β) κονιφερυλο
-

και (γ)
ςιναπυλο
-

αλκοϐλη, απϐ τα οπούα ςυντύθενται τα μακρομϐρια τησ
λιγνύνησ [
Doherty

et

al
., 2011]…
……………………………
……………
..

….
25


Σχήμα

1.7.

΢χηματικϐ μοντϋλο ενϐσ τμόματοσ τυπικοϑ πρωτογενοϑσ
κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ κατϐπιν εγκϊρςιασ τομόσ. Διακρύνονται
τα μικροώνύδια κυτταρύνησ τα οπούα εύναι εμβαπτιςμϋνα ςε μια

12


ϊμορφη μότρα ημικυτταρινικϔν και πηκτινικϔν
πολυςακχαριτϔν. Η μϋςη πλϊκα εύνα
ι η ςτοιβϊδα που ςυγκολλϊ
τα κυτταρικϊ τοιχϔματα γειτονικϔν φυτικϔν κυττϊρων [
Harris
,
2009
]…
……
…………………………………………………………………
………
.

….
26


Σχήμα 2.1.

Απεικϐνιςη των ενζυμικϔν δρϊςεων που εμπλϋκονται ςτην
υδρϐλυςη τησ κυτταρύνησ. Οι ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςεσ
υδρουλϑουν τυχαύα εςωτερικοϑσ 1,4
-
β
-
γλυκοζιτικοϑσ δεςμοϑσ. Η
ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςη ό κελλοβιοϒδρολϊςη αποςπϊ μονϊδεσ
κελλοβιϐζησ απϐ τα αναγωγικϊ και μη αναγωγικϊ ϊκρα των
αλυςύδων κυτταρύνησ. Η κελλοβιϐζη, εν ςυνεχεύα, υδρολϑεται
προσ γλυκϐζη απϐ τη β
-
γ
λυκοζιδϊςη [
Yeoman

et

al
., 2010]

..

….
28


Σχήμα 2.2.

Συπικό δομό μιασ κυτταρινϊςησ. Διακρύνονται η καταλυτικό
υπομονϊδα (
CD
) και η υπομονϊδα πρϐςδεςησ ςακχϊρων (
CBD
).
Σα εξϊγωνα αντιπροςωπεϑουν τα αρωματικϊ αμινοξϋα που
εντοπύζονται ςτισ θϋςεισ πρϐςδεςησ και ευθϑνονται για τισ
αλληλεπιδρϊςεισ με τα ςϊκχαρα που ςυνιςτοϑν τισ αλυςύδεσ
κυτταρύνησ. Σο βϋλοσ υποδεικνϑει το ενεργϐ κϋντρο
[
Hilde
´ &
Johansson
, 2004]………………………
……………………………
…….

…..

….
29


Σχήμα 2.3.

Αναπαρϊςταςη τησ τριςδιϊςτατησ δομόσ τησ καταλυτικόσ
περιοχόσ (μοντϋλο κορδϋλασ)
(
Α) τησ θερμοςταθερόσ
ενδογλουκανϊςησ
E
1 τησ οικογϋνειασ 5 απϐ τον μικροοργανιςμϐ
Acidothermus

cellulolyticus
, παρουςύα του υποςτρϔματοσ τησ
κελλοτετραϐζησ, Β) τησ κελλοβιοϒδρολϊςησ τησ οικογϋνειασ 6
απϐ το μικροοργανιςμϐ
Humicola

insolens
,
(
Γ) τησ
ενδογλουκανϊςησ
V

τησ οικογϋνειασ 45 απϐ τον μικροοργανιςμϐ
Humicola

insolens
,
(
Δ) τησ κελλοβιοϒδρολϊςησ
I

τησ οικογ
ϋνειασ 7
απϐ τον μικροοργανιςμϐ
Trichoderma

reesei
, παρουςύα των
υποςτρωμϊτων κελλοτετραϐζη και κελλοβιϐζη και
(
Ε) τησ
ϋνδο/ϋξω
-
γλουκανϊςησ
Cel
48
F

τησ οικογϋνειασ 48 απϐ τον
μικροοργανιςμϐ
C
lostridium

Cellulolyticum

…………
……..

……

….
31


Σχήμα 2.4.

Οι δϑο
καταλυτικού μηχανιςμού τησ υδρϐλυςησ των γλυκοζιτικϔν
δεςμϔν απϐ γλυκοςιδϊςεσ. ΢την πρϔτη περύπτωςη (Α), η
αντύδραςη προχωρϊ μϋςω ενϐσ μηχανιςμοϑ διπλόσ
αντικατϊςταςησ που οδηγεύ ςτη διατόρηςη τησ ανωμεροϑσ
διαμϐρφωςησ, ενϔ ςτη δεϑτερη περύπτωςη (Β), προχω
ρϊ μϋςω
ενϐσ μηχανιςμοϑ απλόσ α
ντικατϊςταςησ που οδηγεύ ςε
ανα
ςτροφό τησ ανωμεροϑσ
διαμϐρφωςησ. Ο ακολουθοϑμενοσ
καταλυτικϐσ μηχανιςμϐσ εύναι ύδιοσ για τα ϋνζυμα τησ ύδιασ
οικογϋνειασ [
McCarter
,&
Withers
, 1994
]…
……………………

……

….
32


Σχήμα 2.5.

΢χηματικό
απεικϐνιςη τησ υδρϐλυςησ τησ κυτταρύνησ απϐ (Α)
κυτταρινϊςεσ και (Β) κυτταρινϊςεσ οργανωμϋνεσ ςε
πολυενζυμικϊ ςϑμπλοκα, τα κυτταρι
ν
οςϔματα. Διακρύνονται οι
κρυςταλλικϋσ και ϊμορφεσ περιοχϋσ των αλυςύδων κυτταρύνησ
και τα αναγωγικϊ και μη αναγωγικϊ ϊκρα των

αλυςύδων [
Lynd

et

al
., 2002]…
……………………………………………………………………


..

….
34


Σχήμα 2.6.

Απεικϐνιςη των δρϊςεων του ξυλανολυτικοϑ ςυςτόματοσ που
εύναι υπεϑθυνο για την υδρϐλυςη τησ
ξυλϊνησ [
Shallom
, &
Shoham
, 2003]…
………………………………………………………………


….
38


13



Σχήμα 3.1.

Πρϐωρη δημιουργύα ςπορύων ςτον
S
.
thermophile

ϐταν
αναπτϑςςεται ςε θερμοκραςύα 30
ο
C

(ςϑντομοσ κϑκλοσ
κονιδύωςησ

microcycle

conidiation
). Ο μϑκητασ αναπτϑχθηκε
παρουςύα τεμαχιςμϋνου διηθητικοϑ χαρτιοϑ
Whatman

ωσ πηγό
ϊνθρακα. (
A
) Μετϊ απϐ επϔαςη 24 ωρϔν, ο

οργανιςμϐσ παρϊγει
ςπϐρια αγενοϑσ αναπαραγωγόσ (κονύδια). Σο αδιϊλυτο τμόμα
αντιπροςωπεϑει ύνα κυτταρύνησ. (Β) Μετϊ απϐ 72 ϔρεσ,
παρατηρεύται πρϐωρη ανϊπτυξη και διαφοροπούηςη των
κονιδύων [
Maheshwari

et

al
., 2000]…
………………………………

...

….
40


Σχήμα3.2.

Υωτομικρογραφύεσ ϐπου διακρύνονται (Α) νεαρού κονιδιοφορεύσ
του ςτελϋχουσ
IIS

72, (Β) ϔριμοι κονιδιοφορεύσ του ςτελϋχουσ
IIS

72, (Γ) διακλαδϔςεισ των υφϔν του ςτελϋχουσ
IIS

220, (Δ) ϔριμοι
κονιδιοφορεύσ του ςτελϋχουσ
IIS

220, (Ε) υφϋσ που φϋρουν
πλευρικϊ κ
ονύδια [
Bhat

&
Maheshwari
, 1987]…
………
………
……

….
42


Σχήμα 4.1.

Κϑτταρα

του

μικροοργανιςμοϑ

Pichia

pastoris
,
ϐπωσ

φαύνονται

ςε

ηλεκτρονικϐ

μικροςκϐπιο

ςϊρωςησ

(
Scanning

Electron

Microscope
,
SEM
)
…………………………………………………………


..

….
43


Σχήμα 4.2.

Μονοπϊτι καταβολιςμοϑ τησ μεθανϐλησ ςτη μεθυλϐτροφη ζϑμη
Pihia

pastoris
. (
GAP
: 3
-
φωςφορικό γλυκεραλδεϓδη,
DHA
:
διυδροξυακετϐνη,
NAD
: νικοτιναμιδο αδενινο δινουκλεοτύδιο,
NADH
: ανηγμϋνο
νικοτιναμιδο αδενινο δινουκλεοτύ
διο,
GSH
:
ανηγμϋνο γλουταθεύο,
Xu
5
P
: 5
-
φωςφορικό ξυλουλϐζη,
ATP
:
τριφοςφωρικό αδενοςύνη,
ADP
: διφοςφωρικό αδενοςύνη,
DHAP
:
φωςφορικό διυδροξυακετϐνη,
FBP
: 1,6
-
διφωςφορικό φρουκτϐζη,
F
-
6
P
: 6
-
φωςφορικό φρουκτϐζη, 1: αλκοολικό οξειδϊςη, 2:
καταλϊςη, 3: διυδρογενϊςη τησ φορμαλδεϓδησ, 4: διυδρογενϊςη
του φορμικοϑ, 5: ςυνθϊςη τησ διυδροξυακετϐνησ, 6: κινϊςη τησ
διυδροξυακετϐνησ, 7: αλδολϊςη τησ 1,6
-
διφωςφορικόσ
φρουκτϐζησ, 8: φωςφατϊςη τησ 1,6
-
διφωςφορικόσ
φρουκτϐζησ)
[
Zhang

et

al
., 2000
]…………
………………………………………………
..

….
45


Σχήμα 5.1.

Φϊρτησ του πλαςμιδιακοϑ φορϋα κλωνοπούηςησ
pCR
®

Blunt

(
Invitrogen
). Διακρύνονται τα βαςικϊ χαρακ
τ
ηριςτικϊ του
πλαςμιδύου: η θϋςη ϋναρξησ τησ αντιγραφόσ
PUC

ori
, ο
υποκινητόσ
lac

ο οπούοσ ρυθμύζει την ϋκφραςη του γονιδύου
ςϑντηξησ
lac
Z
α
-
ccd
B
, καθϔσ και τα γονύδια που προςδύδουν
ανθεκτικϐτητα ςτα αντιβιοτικϊ καναμυκύνη και ζεοςύνη

….
..

….
54


Σχήμα 5.2.

Φϊρτησ του

πλαςμιδιακοϑ φορϋα ϋκφραςησ
pPICZ
α
C

(
Invitrogen
).
Διακρύνονται τα βαςικϊ χαρακτηριςτικϊ του πλαςμιδύου: το
ςημεύο ϋναρξησ τησ αντιγραφόσ
pUC

ori
, ο υποκινητόσ του
γονιδύου τησ αλκοολικόσ οξειδϊςησ (5’ ΑΟΦ1), η περιοχό τησ
ςηματοδοτικόσ αλληλουχύασ α
-
factor

για την ϋκκριςη τησ
ετερϐλογησ πρωτεϏνησ, το γονύδιο που προςδύδει ανθεκτικϐτητα
ςτο αντιβιοτικϐ ζεοςύνη (
Zeocin
), η αλληλουχύα του επιτϐπου
c
-
myc

(
c
-
myc

epitope
) για την ανύχνευςη τησ αναςυνδυαςμϋνησ
πρωτεϏνησ με το αντύςτοιχο αντύςωμα και η αλληλουχύα π
ου
κωδικοποιεύ τα ϋξι ςυνεχϐμενα κατϊλοιπα ιςτιδύνησ (6×
His
) για
τον καθαριςμϐ τησ πρωτεϏνησ με τη χρόςη χρωματογραφύασ
ςυγγϋνειασ ακινητοποιημϋνου μετϊλλου…
………………………….
..

….
55


14


Σχήμα 5.3.


Απεικϐνιςη των ςταδύων ςε ϋνα κϑκλο αλυςιδωτόσ αντύδραςησ
πολυμερϊςη
σ (
Polymerase

Chain

Reaction
,
PCR
). Κϊθε κϑκλοσ
ξεκινϊ με θϋρμανςη ςτουσ 95
o
C
, ϐπου το μϐριο
DNA

μετουςιϔνεται και χωρύζεται ςε δϑο μονϐκλωνουσ κλϔνουσ. ΢τη
ςυνϋχεια, η θερμοκραςύα μειϔνεται και οι εκκινητϋσ υβριδύζονται
με τισ ςυμπληρωματικϋσ προσ αυτοϑσ
αλληλουχύεσ ςτουσ δϑο
κλϔνουσ του
DNA
. Η θερμοκραςύα του ςταδύου αυτοϑ
καθορύζεται με βϊςη τη θερμοκραςύα τόξησ των εκκινητϔν (Σ
m
).
Σϋλοσ, η θερμοκραςύα αυξϊνεται ςτουσ 72
o
C

και η
DNA

πολυμερϊςη καταλϑει τη ςϑνθεςη
DNA

με τη βοόθεια των
εναρκτόριων μορύων
. Επανειλημμϋνοι κϑκλοι αντιγραφόσ
οδηγοϑν ςε εκθετικϐ πολλαπλαςιαςμϐ τησ αλληλουχύασ
-
ςτϐχου
[
Siqueira

&
R
ô
cas
, 2003
]…
………………………………………
…….


….
58


Σχήμα 5.4.

Απεικϐνιςη των ςταδύων τησ αλυςιδωτόσ αντύδραςησ
πολυμερϊςησ επικϊλυψησ/επϋκταςησ (
Overlap

extension

polymerase

chain

reaction
,
OE
-
PCR
). Αρχικϊ, κϊθε μια απϐ τισ
αλληλουχύεσ
-
ςτϐχοι ενιςχϑονται ςε ξεχωριςτϋσ
PCR

με τη βοόθεια
εκκινητϔν (Β και Γ) που φϋρουν ςυμπληρωματικϊ ϊκρα με
αποτϋλεςμα τα προώϐντα που προκϑπτουν να φϋρουν
επικαλυπτϐμενα ϊκρα. Σα επικαλ
υπτϐμενα τμόματα υβριδύζονται
και παρϊλληλα δρουν ωσ εκκινητϋσ για την επιμόκυνςη κϊθε
κλϔνου. Σο τελικϐ προώϐν αποτελεύται απϐ τισ δϑο αλληλουχύεσ
-
ςτϐχουσ [
Warrens

et

al
., 1997
]…
…………
………………………
……

….
60


Σχήμα 6.1.

Νουκλεοτιδικό

αλληλουχύα

του

γονιδύου

StCBH

του

Sporotrichum

thermophile
.
Σο γονύδ
ι
ο αποτελεύται απϐ δϑο εξϔνια μόκουσ 409
bp

και 1172
bp
, αντύςτοιχα, και ϋνα εςϔνιο μόκουσ 67
bp
. Σα 17 πρϔτα
αμινοξικϊ κατϊλοιπα αντιςτοιχοϑν ςτην ςηματοδοτικό αλληλουχύα
ϋκκριςησ. Εντϐσ του πλαιςύου αποδύδεται η αμιν
οξικό αλληλουχύα τησ
περιοχόσ δϋςμευςησ ςακχϊρων (
CBM
), ϐπωσ προβλϋφθηκε με το
πρϐγραμμα
Pfam

[
Finn

et

al
., 2009], ενϔ ςημειϔνονται οι πιθανϋσ
περιοχϋσ
N
-
γλυκοζυλύωςησ (ϊγκιςτ
ρ
ο) και Ο
-
γλυκοζυλύωςησ
(αγκϑλεσ)

ϐπωσ προςδιορύςτηκαν με τα προγρϊμματα
NetNGlyc

[
Gupta

et

al
.,2004] και
NetOGlyc

[
Julenius

et

al
.
, 2005],
αντύςτοιχα
……………

………………………………………………………
………

….
73


Σχήμα

6.2
.


Ηλεκροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων που
προϋκυψαν απϐ την
PCR

για την ενύςχυςη του γονιδύου
StCBH
7 απϐ
το γονιδιακϐ
DNA

του
S
.
thermophile
. ΢την ύδια πηκτό
ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ
το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα φωτογραφόθηκε υπϐ
υπεριϔδη καταϑγαςη

…………………………………………………………


….
75


Σχήμα

6.3
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων των
αντιδρϊςεων

πϋψησ του αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύου
pCR
®

Blunt

με τα περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και

XbaI
. ΢τισ θϋςεισ 1
-
3

διακρύνονται
οι ζϔνεσ που προϋκυψαν απϐ τον ηλεκτροφορητικϐ διαχωριςμϐ των
προ
ώϐντων των αντιδρϊςεων πϋψησ 1
-
3,

αντύςτοιχα. ΢την ύδια πηκτό
ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν μεγεθϔν
(ενδεύκτησ μοριακϔν
μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ

το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα φωτογραφόθηκε υπϐ
υπεριϔδη καταϑγαςη

……………………………………………………
………

….
76



15


Σχήμα
6.4
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ υψηλόσ καθαρϐτητασ 1%
w
/
v

των προώϐντων των
αντιδρϊςεων

πϋψησ του αναςυνδυαςμϋνου
πλαςμιδύου
pCR
®

Blunt

με τα περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και

XbaI
. ΢την
ύδια πηκτό ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν
μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα
φωτογραφόθηκε υπϐ υπεριϔδη καταϑγαςη

……………
……………

….
77


Σχήμα

6.5
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πηκτό αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων που
προϋκυψαν απϐ τισ δϑο
PCR

για την ενύςχυςη των δϑο εξωνύων του
γονιδύου
StCBH
7. Η ζϔνη ςτη θϋςη 1 αντιςτοιχεύ ςτο προώϐν τησ
PCR

για την επαϑξηςη του εξωνύου με μόκοσ 409
bp

και η ζϔνη ςτη θϋςη
2 ςτο προώϐν τησ
P
CR

για την επαϑξηςη του εξωνύου με μόκοσ 1172
bp
. ΢την ύδια πηκτό ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
:
200
bp
-
10
kb
). Μετϊ το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκ
τωμα
φωτογραφόθηκε υπϐ υπεριϔδη καταϑγαςη

………………………


….
78


Σχήμα

6.6
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πηκτό αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των τελικϔν προώϐντων
τησ
OE
-
PCR
. ΢την ύδια πηκτό ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν
μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα
φωτογραφόθηκε υπϐ υπεριϔδη καταϑγαςη

……………………
……

….
79


Σχήμα
6.7
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων των
αντιδρϊςεων

πϋψησ του αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύου
pCR
®

Blunt

με τα περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και

XbaI
. ΢το πλαςμύδιο ϋχει ειςαχθεύ
το γονύδιο
StCBH
7 χωρύσ το εςϔνιο

μόκουσ 67
bp
. ΢τισ θϋςεισ 1
-
3
διακρύνονται οι ζϔνεσ που προϋκυψαν απϐ τον ηλεκτροφορητικϐ
διαχωριςμϐ των προώϐντων των αντιδρϊςεων πϋψησ 1
-
3 αντύςτοιχα.
΢την ύδια πηκτό ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν
μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200

bp
-
10
kb
). Μετϊ το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα
φωτογραφόθηκε υπϐ υπεριϔδη καταϑγαςη

………………………

.

….
80


Σχήμα
6.8
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων των
αντιδρϊςεων

πϋψησ του αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύου
pPICZ
α
C

με
τα περιοριςτικϊ ϋνζυμα
ClaI

και

XbaI
. ΢τισ θϋςεισ 1
-
3 διακρύνονται οι
ζϔνεσ που προϋκυψαν απϐ τον ηλεκτροφορητικϐ διαχωριςμϐ των
προ
ώϐντων των αντιδρϊςεων πϋψησ 1
-
3 αντύςτοιχα. ΢την ύδια πηκτό
ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν μεγεθϔν

(ενδεύκ
τησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ
το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα φωτογραφόθηκε υπϐ
υπεριϔδη καταϑγαςη
……
…………………………………………………
………

….
82


Σχήμα

6.9
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πηκτό αγαρϐζησ 1%
w
/
v

των προώϐντων των
αντιδρϊςεων πϋψησ του αναςυνδυαςμϋνου πλαςμιδύου
pPICZ
α
C

με το περιοριςτικϐ ϋνζυμο
PmeI
. ΢τισ θϋςεισ 1
-
3 διακρύνονται οι
ζϔνεσ που προϋκυψαν απϐ τον ηλεκτροφορητικϐ διαχωριςμϐ των
προώϐντων των αντιδρϊςεων πϋψησ 1
-
3 αντύςτοιχα. ΢την ύδια

πηκτό ηλεκτροφορόθηκε μύγμα κλαςμϊτων
DNA

γνωςτϔν
μεγεθϔν

(ενδεύκτησ μοριακϔν μεγεθϔν
Hyperladder

I
: 200
bp
-
10
kb
). Μετϊ το πϋρασ τησ ηλεκτροφϐρηςησ, το πόκτωμα
φωτογραφόθηκε υπϐ υπεριϔδη καταϑγαςη

……………………
..

….
83



16


Σχήμα

6.10
.

Διϊγραμμα μεταβολόσ τησ οπτικόσ πυκνϐτητασ,
OD
600
nm
, του μϋςου
καλλιϋργειασ ςε ςχϋςη με το
χρϐνο επϔαςησ των καλλιε
ργειϔν
κυττϊρων
Pichia

pastoris

ςε θρεπτικϐ μϋςο ΒΜΜΤ (
B
uffered

C
omplex

M
ethanol

M
edium
) ϐγκου 50
mL

…………………………

..

….
84


Σχήμα
6.11
.

Πρϐτυπη καμπϑλη διαλυμϊτων γνωςτϔν ςυγκεντρϔςεων
γλυκϐζησ, που ςυςχετύζει μονϊδεσ
ο
πτικόσ απορρϐφηςησ ςτα 540
nm

με ςυγκϋντρωςη ανηγμϋνων ςακχϊρων ςτο δεύγμα

……
..

….
85


Σχήμα

6.12
.

Απεικϐνιςη των ςυνθηκϔν και των αποτελεςμϊτων τησ
χρωματογραφύασ ςυγγϋνειασ

ακινητοποιημϋνου μετϊλλου (
IMAC
)

για την απομϐνωςη και τον καθαριςμϐ τησ αναςυνδυαςμϋνησ
πρωτεϏνησ. Η περιοχό (Α) αντιςτοιχεύ ςτην ϋκλουςη με
Talon

1
x

των
πρωτεώνϔν που δε φϋρουν τα κατϊλοιπα ιςτιδύνησ και ςυνεπϔσ δεν
προςδϋνονται ςτη ςτόλη.

Η περιοχό (Β)

αντιςτοιχεύ ςτη ε
κλουϐμενη
πρωτεϏνη και αντιπροςωπεϑει διϊλυμα ϐγκου 45
mL
. Η
αναςυνδυαςμϋνη πρωτεϏνη εκλοϑεται κατϐπιν προςθόκησ ςτην
κινητό φϊςη διαλϑματοσ
Talon

αυξανϐμενησ ςυγκϋντρωςησ
ιμιδαζολύου απϐ 0 ϋωσ 100
mM
, το οπούο ςυναγωνύζεται τα
κατϊλοιπα
ιςτιδύνησ για την πρϐςδεςη ςτη μότρα κοβαλτύου

...

….
86


Σχήμα
6.13
.

Ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα πολυακρυλαμύδησ τησ καθαρόσ
αναςυνδυαςμϋνησ
πρωτεϏνησ

…………………………………………
……

….
87


Σχήμα
6.14
.

Μοντϋλο τησ τριςδιϊςτατη δομόσ τησ αναςυνδυαςμϋνησ πρωτεϏνησ
StCBH
7 ϐπωσ προκϑπτει με τη βοόθεια του υπολογιςτικοϑ
προγρϊμματοσ
SWISS
-
MODEL
, χρηςιμοποιϔντασ ωσ αλληλουχύα
οδηγϐ τη δομό μιασ κελλοβιοϒδρολϊςησ του
Trichoderma

Reesei

με
την οπούα παρουςιϊζει ποςοςτϐ ομοιϐτητασ 76%, κατϐπιν ςτούχιςησ
με τον υπολογιςτικϐ αλγϐ
ριθμο
BLAST

[Altschul
et al
., 1990]
.
΢το
ςχόμα αριθμοϑνται οι διςουλφιδικού δεςμού του μορύου ενϔ με
μαϑρο χρϔμα υποδεικνϑεται το κϋντρο Ν
-
γλυκοζυλύωςησ, ϐπωσ
προβλϋφθηκε με το υπολογιςτικϐ εργαλεύο
Ν
etNGlyc
……
…………………………………………………………………………


….
89


















17





18


Κεφάλαιο 1

Η φυτική βιομάζα ωσ πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοκαυςίμων















1.1
Παραγωγό βιοαιθανϐλησ απϐ βιομϊζα λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ


Η διαφαινϐμενη εξϊντληςη των αποθεμϊτων ορυκτϔν καυςύμων που βϊλλει την
ενεργειακό επϊρκεια του
τεχνολογικοϑ πολιτιςμοϑ και η ςυνεχόσ υποβϊθμιςη του
περιβϊλλοντοσ οριοθετοϑν τη μεταςτροφό προσ αειφϐρεσ και ενεργειακϊ καθαρϋσ
πρακτικϋσ με την ενςωμϊτωςη των ανανεϔςιμων πηγϔν ενϋργειασ ςτο διεθνϋσ
ενεργειακϐ ιςοζϑγιο. Η υφιςτϊμενη ςυμμετοχό των ανανεϔς
ιμων πηγϔν ενϋργειασ ςτην
παγκϐςμια ενεργειακό κατανομό ανϋρχεται ςτο 11 %, ενϔ το 50 % αυτοϑ του δυναμικοϑ
ςχετύζεται με τη βιομϊζα.

Η ενεργειακό αξιοπούηςη τησ βιομϊζασ μπορεύ να πραγματοποιηθεύ, εύτε με
καϑςη τησ αυτοϑςιασ ό τυποποιημϋνησ ςτερεόσ ϑλησ,
εύτε με μετατροπό τησ ςε υγρϐ ό
αϋριο βιοκαϑςιμο μϋςω θερμοχημικϔν ό βιοχημικϔν διεργαςιϔν. Οι πηγϋσ βιομϊζασ που
διατύθενται για ενεργειακοϑσ ςκοποϑσ διακρύνονται ςτισ υπολειμματικϋσ μορφϋσ
βιομϊζασ, ϐπωσ τα υπολεύμματα γεωργικϔν καλλιεργειϔν (ςτελϋχη, κλ
αδιϊ, φϑλλα,
ϊχυρο), τα υπολεύμματα επεξεργαςύασ γεωργικϔν προώϐντων (υπολεύμματα
επεξεργαςύασ ξϑλου, πυρόνεσ καρπϔν) και η βιομϊζα δαςικόσ προϋλευςησ (υπολεύμματα
επεξεργαςύασ ξϑλου, καυςϐξυλα) και ςτα ενεργειακϊ φυτϊ τα οπούα διακρύνονται ςε
ςακχαροϑχα φ
υτϊ (ςακχαροκϊλαμο, ςακχαρϐτευτλο, ςϐργο), αμυλοϑχα φυτϊ (ςπϐροι
ςιτηρϔν) καθϔσ και ςε ενεργειακϊ φυτϊ λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ (ευκϊλυπτοσ,
ψευδακακκύα, κενϊφ, κυτταρινοϑχου ςϐργο, μύςχανθοσ, αγριαγκινϊρα, καλϊμι). ΢αφϔσ,
η χρόςη αμυλοϑχων και ςακχαρ
οϑχων φυτϔν για την παραγωγό ενϋργειασ κρύνεται
επιςφαλόσ και επιςϑρει μια ςειρϊ προβληματιςμϔν ηθικοκοινωνικοϑ χαρακτόρα λϐγ
ω
τησ ενδεχϐμενησ διατϊραξησ του

τροφικοϑ ανεφοδιαςμοϑ και κατ’ επϋκταςη τησ
τροφικόσ αςφϊλειασ. Εντοϑτοισ, η παραγωγό ενϋργειασ δϑ
ναται να βαςιςτεύ
αποκλειςτικϊ ςτην αξιοπούηςη του μη εδϔδιμου τμόματοσ τησ βιομϊζασ, δηλαδό τη
βιομϊζα λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ. Σα βιοκαϑςιμα που προϋρχονται απϐ την
αξιοπούηςη τησ λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ ονομϊζονται βιοκαϑςιμα δεϑτερησ
γενιϊσ
.

Η ανϊπτυξη βιοχημικϔν διεργαςιϔν για την παραγωγό βιοαιθανϐλησ δεϑτερησ
γενιϊσ ςυνύςταται ςτην υιοθϋτηςη των εργαλεύων και πρακτικϔν τησ Βιομηχανικόσ (ό
Λεϑκησ) Βιοτεχνολογύασ ςτα πλαύςια των ευρϑτερων αρχϔν ςτο οπούο εδρϊζονται οι
προςεγγύςεισ τησ για την

ανϊπτυξη καθαρϔν και βιϔςιμων βιομηχανικϔν διεργαςιϔν. Οι
διεργαςύεσ παραγωγόσ βιοαιθανϐλησ απϐ βιομϊζα λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ
διεκπεραιϔνεται ςε ϋνα ςϑνολο ςταδύων, με κυριϐτερα την υδρϐλυςη τησ βιομϊζασ ςε
ςϊκχαρα, τη βιομετατροπό των παραχθϋντων

ςακχϊρων με ζϑμωςη απϐ

19


αιθανολοπαραγωγοϑσ μικροοργανιςμοϑσ και τον διαχωριςμϐ για ανϊκτηςη των
παραγϐμενου

κλϊςματοσ βιοαιθανϐλησ
[
S
á
nchez
, 2009
]
.




Σχήμα
1.1
.

Συπικϐ διϊγραμμα ροόσ διεργαςύασ παραγωγόσ βιοαιθανϐλησ απϐ βιομϊζα
λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςτ
αςησ. Απεικονύζονται τα βαςικϊ ςτϊδια ςτα οπούα ςυντελεύται η
διεργαςύα. Η υδρϐλυςη τησ λιγνινοκυτταρινοϑχου φυτικό ϑλησ μπορεύ να πραγματοποιηθεύ
με τη χρόςη χημικϔν ό ενζυμικϔν υδρολυτικϔν μϋςων.
Όταν η ςακχαροπούηςη τησ βιομϊζασ
πραγματοποιεύται με ενζυμικό υδρϐλυςη, κρύνεται απαραύτητο ϋνα επιπρϐςθετο ςτϊδιο
προκατεργαςύασ μϋςω φυςικϔν, χημικϔν, βιολογικϔν ό ςυνδυαςμϋνων
μεθϐδων. Η

προκατεργαςύα ςτοχεϑει ςτη διϊςπαςη τησ περύπλοκησ δομόσ του λιγν
ινοκυτταρ
ινοϑχου
υλικοϑ και ςτην κλαςμϊτω
ςη τησ βιομϊζασ με απομϊκρυνςη τησ ημικυτταρύνησ και τησ
λιγνύνησ, καθϔσ και ςτην αϑξηςη τησ επιδεκτικϐτητασ του υποςτρϔματοσ ςε προςβολό απϐ
το υδρολυτικϐ μϋςο, με αϑξηςη τησ επιφϊνειασ
επαφόσ [
Szczodrak

&
Fiedurek
, 1996
;
Sun

&
Cheng
, 2002
].



Η υδρϐλυςη τησ λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ ςε απλϊ ςϊκχαρα μπορεύ να
γύνει, εύτε με χρόςη αραιοϑ ό πυκνοϑ διαλϑματοσ οξϋοσ (ϐξινη υδρϐλυςη), εύτε με τη
βοόθεια υδρολυτικϔν ενζϑμων (ενζυμικό υδρϐλυςη) [
Mabee
, 2011
]. Οι
ςυνθόκεσ
υψηλϔν θερμοκραςιϔν που διϋπουν τισ διεργαςύεσ ϐξινησ υδρϐλυςησ επιφϋρουν την
αποδϐμηςη των παραγϐμενων ςακχϊρων (πεντοζϔν και εξοζϔν) και την παραγωγό
παρεμποδιςτϔν που αναςτϋλλουν την μικροβιακό ανϊπτυξη των ζυμωτ
ικ
ϔν
οργανιςμϔν [
Wyman
, 1994
;
Ba
lat
, 2011
]. Επιπρϐςθετα, η χρόςη πυκνϔν διαλυμϊτων
οξϋων προκαλεύ προβλόματα

διϊβρωςησ του μηχανολογικοϑ εξοπλιςμοϑ, ενϔ η
βιωςιμϐτητα των διεργαςιϔν αυτϔν εξαρτϊται απϐ την εγκατϊςταςη ςυςτημϊτων
ανϊκτηςησ των χρηςιμοποιοϑμενων
οξϋων [
Sun

&
Cheng
, 2002
].
Αντύθετα, η υψηλό
εξειδύκευςη των ενζϑμων ςτισ αντιδρϊςεισ που

καταλϑουν αποτρϋπει το ςχηματιςμϐ
παραπροώϐντων, ςυμβϊλλοντασ ςτην αϑξηςη τησ απϐδοςησ τησ διεργαςύασ, ενϔ
παρϊλληλα ελαχιςτοποιεύται το κϐςτοσ διαχεύριςησ των
αποβλότων [
Wyman
, 1994
].

Σϋλοσ, ο
ι όπιεσ ςυνθόκεσ που επικρατοϑν κατϊ την ενζυμικό υδρϐλυςη, μειϔνουν τισ
απαιτόςεισ τησ διεργαςύασ ςε ενϋργεια
παροχϔν [
Szczodrak

&
Fiedurek
, 1996
].

Σα πλεονεκτόματα τησ ενζυμικόσ ϋναντι τησ χημικόσ υδρϐλυςησ ϋχουν ςτρϋψει
το ερευνητικϐ ενδιαφϋρον ςτην απο
μϐνωςη ενζυμικϔν ςυςτημϊτων απϐ βακτόρια και
μϑκητεσ που ενϋχονται ςτην υδρϐλυςη τησ λιγνινοκυτταρινοϑχου ϑλησ ςε απλϊ ςϊκχαρα
κατϊλληλα για βιομετατροπό. Σα ϋνζυμα που χρηςιμοποιοϑνται ςτισ βιομηχανικϋσ
εφαρμογϋσ προϋρχονται επύ το πλεύςτον απϐ μεςϐφιλουσ

μικροοργανιςμοϑσ. Ωςτϐςο,
παρϊ την μεγϊλη υδρολυτικό ικανϐτητα τουσ, τα ϋνζυμα αυτϊ ςτεροϑνται τησ
θερμοανθεκτικϐτητασ που απαιτεύται για την υδρϐλυςη τησ περύπλοκησ δομόσ των
βιοπολυμερϔν τησ φυτικόσ βιομϊζασ λιγνινοκυτταρινοϑχου ςϑςταςησ ςε ςυνθόκεσ
παρ
ατεταμϋνησ επϔαςησ και υψηλϔν θερμοκραςιϔν, μεταθϋτοντασ ςτο επύκεντρο των
ερευνητικϔν δραςτηριοτότων την απομϐνωςη ενζϑμων που προϋρχονται απ
ϐ
θερμϐφιλουσ μικροοργανιςμοϑσ.


20


1.2
Κϑρια ςυςτατικϊ λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ


Σο κυτταρικϐ τούχωμα

των φυτικϔν κυττϊρων ςϑγκειται

κυρύ
ωσ απϐ τρεισ
πολυμερεύσ ενϔςεισ,

την κυτταρύνη, την ημικυτταρύνη και τη λιγνύνη

και, ςε μικρϐτερο
μϋροσ, απϐ εκχυλύςιμα ςυςτατικϊ και τϋφρα

[
Ach
yuthan

et

al
., 2010
]
. Η ςϑςταςη τησ
λιγνινοκυτταρινοϑχου βιομϊζασ διαφοροποι
εύται ανϊμεςα ςτα φυτικϊ εύδη ανϊλογα με
την προϋλευςό τουσ. Γενικϊ, ςυνύςταται απϐ κυτταρύνη ςε εκατοςτιαύα κατϊ βϊροσ
περιεκτικϐτητα ύςη με 35
-
50%, ημικυτταρύνη ςε ποςοςτϐ 20
-
35%
, και λιγνύνη ςε
ποςοςτϐ 10
-
25% [
Saha
, 2003].



1.2.1
Κυτταρύνη


Η κυτταρύνη εύναι ϋνασ γραμμικϐσ ομοπολυςακχαρύτησ που ςυντύθεται απϐ
μονϊδεσ
β
-
D
-
γλυκοπυρανϐζησ ςυνδεδεμϋνεσ με 1,4
-
β
-
γλυκοζιτικοϑσ δεςμοϑσ. Κϊθε
μονομερϋσ περιςτρϋφεται γϑρω απϐ τον 1,4
-
β
-
γλυκοζιτικϐ δεςμϐ κατϊ 180
o

ωσ προσ το
γειτνιϊζον μονομερϋσ, καθις
τϔντασ τον διςακχαρύτη κελλοβιϐζη τη μικρϐτερη
επαναλαμβανϐμενη δομικό μονϊδα του μακρομορύου.
Η κυτταρύνη ϋχει μεταβαλλϐμενο
βαθμϐ πολυμεριςμοϑ ανϊλογα με την προϋλευςη τησ, ο οπούοσ κυμαύνεται απϐ
100 ϋωσ
20000 [
Zhang

&
Lynd
, 2004;
Saratale

et

al
., 2008
]
.




Σχήμα

1.2
.

Μοριακό δομό τησ κυτταρύνησ, ϋνα 1,4
-
Ο
-

-
D
-
γλυκοπυρανοζιτικϐ) πολυμερϋσ.
Εντϐσ των αγκυλϔν απεικονύζεται η επαναλαμβανϐμενη δομικό μονϊδα του μακρομορ
ύου, ο
διςακχαρύτησ κελλοβιϐζη
,

ενϔ με
n

υποδηλϔνεται ο αριθμϐσ των δομικϔν μονϊδων ανϊ
αλυςύδα. Επύςησ, επιςημαύνεται το αναγωγικϐ ϊκρο τησ
αλυςύδασ [
P
é
rez

&

Samain
, 2010].



Δεςμού υδρογϐνου αναπτϑςςονται μεταξϑ
διαδοχικϔν
μορύων γλυκϐζησ τησ ύδιασ
αλυςύδασ (
OH
-
3’…
O
-
5 και
OH
-
2…
O
-
6’), καθϔσ και

μεταξϑ μορύων γλυκϐζησ που ανόκουν
ςε διαφορετικϋσ αλυςύδεσ κυτταρύνησ

(
OH
-
6’…
O
3)
. Οι διαμοριακϋσ γϋφυρεσ υδρογϐνου
ςυντελοϑν ςτη διευθϋτηςη των επιμόκων μορύων κυτταρύνησ ςε παρϊλληλη επύπεδη
διϊταξη, ενϔ οι δεςμού υδρογϐνου και οι
αςθενεύσ
δυνϊμεισ
van

der

Waals

που
αναπτϑςςονται μεταξϑ των επιπϋδων ϋχουν ωσ αποτϋλεςμα τη δημιουργύα υψηλόσ
τϊξησ κρυςταλλικϔν περιοχϔν. Αυτό η ευθυτενόσ διευθϋτηςη των μακρομορύ
ων
κυτταρύνησ
οδηγεύ ςτο ςχηματιςμϐ των ςτοιχειωδϔν ινιδύων

(
protofibrils
)
, η παρϊλληλη
διϊταξη τ
ων οπούων με τη ςειρϊ τησ,
ςυντελεύ

ςτ
η
ν εναπϐθεςη τησ κυτταρύνησ

με τη
μορφό
ςυμπαγϔν
ινωδϔν μι
κροδομϔν, των μικροώνιδύων (
microfibrils
), με ςυμμετοχό
30
-
40 μορ
ύων κυτταρύνησ ανϊ μικροώνύδιο.

΢τη ςυνϋχεια, ομϊδεσ μικροώνιδύων
ςυνδϋονται μεταξϑ τουσ και ςχ
ηματύζουν τα ινύδια (
fibrils
), τα οπούα τελικϊ
ςυμπλϋκονται με τη βοόθεια των ϊμορφων μακρομοριακϔν αλυςύδων ημικυτταρύνησ και
λιγνύνησ προσ ςχηματιςμϐ των ινϔν (
fibers
) κυτταρύνησ.

[
P
é
rez

&

Samain
,

2010;

Lynd

et

al
., 2002;

Hon
, 1994
]

Σα υψηλϊ επύπεδα οργϊνωςησ που χαρακτηρύζουν τισ κρυςταλλικϋσ περιοχϋσ
διαδϋχονται, ωςτϐςο, και ϊμορφεσ ό παρακρυςταλλικϋσ περιοχϋσ. Η πυκνϐτητα τησ

21


κρυςταλλικόσ φϊςησ εύναι 1.55
g
/
cm
3

που αντιςτοιχεύ ςε βαθμϐ κρυςταλλικϐτητασ
περύπου 70%.

[
P
é
rez

&

Samain
,

2010
]
.

Λϐγω τησ κρυςταλλικόσ τησ δομόσ, η κυτταρύνη εμφανύζεται ιδιαύτερα ανθεκτικό
ςε χημικό και ενζυμικό προςβολό
.
Σα μικροώνύδια, με διϊμετρο 20
-
200 Å και μόκοσ
αρκετϔν μικρομϋτρων, προςδύδουν ακαμψύα ςτο κυτταρικϐ τούχωμα των φυτικϔν
κυττϊρων.

Η μεγϊλ
η αντοχό τησ κυτταρύνησ ςε αξονικϐ εφελκυςμϐ καθιςτϊ τα φυτικϊ
κϑτταρα
ικανϊ να ανϋχονται μεγϊλη διαφορϊ ωςμωτικόσ πύεςησ διαμϋςου τησ
κυτταρικόσ μεμβρϊνησ
αλλϊ και να ανθύςτανται ςε μηχανικό καταπϐνηςη.

[
Lynd

et

al
.,
2002;
B
é
guin

&
Aubert
,
1994
;

P
é
rez

&

Samain
]




Σχήμα
1.3
.

Οι δεςμού υδρογϐνου
που αναπτϑςςονται μεταξϑ μορύων γλυκϐζησ τησ ύδιασ
αλυςύδασ καθϔσ και μεταξϑ μορύων γλυκϐζησ που ανόκουν ςε διαφορετικϋσ αλυςύδεσ
κυτταρύνησ
διευθετοϑν τισ αλυςύδεσ ςε παρϊλληλη επύπεδη διϊταξη προκαλϔντασ
ταυτϐχρονα το ςχηματιςμϐ υδρογονικϔν δεςμϔν μεταξϑ των
παρϊλληλων επιπϋδων
κυτταρύνησ. Σο εκτεταμϋνο αυτϐ δύκτυο υδρογονικϔν δεςμϔν ϋχει ωσ αποτϋλεςμα τη
δημιουργύα ςυμπαγϔν

και δϑςκολα αποικ
ο
δομόςιμων κρυςταλλικϔν

περιοχ
ϔν
.

[Liu & Sun,
2010
]



Σχήμα

1.4
.

Οργϊνωςη τησ κυτταρύνησ ςε δομϋσ αυξανϐμενησ πολυπλοκϐτητασ, απϐ το μϐριο
ϋωσ το κυτταρικϐ τούχωμα.

[
Roberts
, 1996
]


22


Τπϊρχουν τϋςςερα

αλλϐμορφα τησ κρυςταλλικόσ κυτταρύνησ: η κυτταρύνη
I
,
II
,
III
, και
IV
.
Η κυτταρύνη που απαντϊται ςτη φϑςη, η κυτταρύνη
I
, ςυνύςταται απϐ δυο
διαφορετικϋσ κρυςταλλικϋσ δομϋσ: την κυτταρύνη
I
α

και την κυτταρύνη
I
β
, οι οπούεσ
διαφϋρουν ωσ προσ τουσ
υδρο
γονικοϑσ δεςμοϑσ που αναπτϑςςονται μεταξϑ των
γειτονικϔν αλυςύ
δων. Η κυτταρύνη
I
α

κρυςταλλϔνεται ςτο τρικλινϋσ ςϑςτημα, ενϔ η
κυτταρύνη
I
β

ςτο μονοκλινϋσ. Η κυτταρύνη
I
α

εύναι θερμοδυναμικϊ λιγϐτερο ςταθερό ςε
ςχϋςη με την κυτταρύνη
I
β

και μπορεύ να μετατραπεύ αναντύςτρεπτα ςτην κυτταρύνη
I
β

με
υδροθερμικό κατεργαςύα
.

[
Atalla

&
VanderHart
, 1984;
B
é
guin

&
Aubert
, 1994;

P
é
rez

&

Samain
,

2010;
Sugiyama

et

al
., 1990
;
]




Σχήμα
1.5
.

΢τοιχειϔδησ κυψελύδα τησ κυτταρύνησ
I
α

και τησ κυτταρύνησ
I
β
.



1.2.
2

Ημικυτταρύνη


Ο ϐροσ ημικυτταρύνη εύναι ςυλλογικϐσ και αναφϋρεται ςε μια

ετερογενό ομϊδα
πολυμερϔν αποτελοϑμενων απϐ πεντϐζεσ (β
-
D
-
ξυλϐζη, α
-
L
-
αραβινϐζη, α
-
L
-
ραμνϐζη και
α
-
L
-
φουκϐζη), εξϐζεσ (β
-
D
-
μαννϐζη, β
-
D
-
γλυκϐζη, α
-
D
-
γαλακτϐζη) και ουρονικϊ οξϋα (α
-
D
-
γλυκουρονικϐ οξϑ, α
-
D
-
4
-
Ο
-
μεθυλ
-
γλυκουρονικϐ οξϑ και α
-
D
-
γαλακτουρονικϐ
οξϑ)
[
G
í
rio

et

al
., 2010
]. Οι ημ
ικυτταρύνεσ δεν ςυναντϔνται ελεϑ
θερεσ ςτη φϑςη αλλϊ η
παρουςύα τουσ ςυνοδεϑεται πϊντοτε απϐ την κυτταρύνη και τη λιγνύνη.
Εύναι ϊμορφεσ
και ϋχουν χαμηλϐ βαθμϐ πολυμεριςμοϑ (100
-
200)
[
Kuhad

et

al
.

1997
;

Li

et

al
., 2007
]. Η
ϑπαρξη πολλϔν υδροξυλ
-

και ακετυλο
-

ομϊδων ςτο μϐριϐ τουσ τισ καθιςτϊ εν μϋρει
διαλυτϋσ ςε νερϐ και ϋντονα υγροςκοπικϋσ
[
Li

et

al
., 2007
]. Επύςησ, διαλϑονται ςε
διαλϑματα αλκϊλεων και υδρολϑονται με αραιϊ διαλϑματα οξϋων
[
Lee
, 1997
].

Η κατηγοριοπούηςη

των ημικυτταρινϔν πραγματοποιεύται με κριτόριο
ταξινϐμηςησ το κυριϐτερο μονομερϋσ ςϊκχαρο. Έτςι, οι ημικυτταρύνεσ διακρύνονται ςε:
γλυκϊνεσ, μαννϊνεσ, αραβινϊνεσ, γαλακτϊνεσ και ξυλϊνεσ. ΢τη φϑςη, οι ημικυτταρύνεσ
ςπϊνια αποτελοϑνται απϐ ϋνα μϐνο τϑπο μον
οςακχαρύτη.
΢υνιςτοϑν πολϑπλοκεσ δομϋσ
που περιλαμβϊνουν περιςςϐτερουσ του ενϐσ τϑπου ετεροπολυςακχαρύτεσ με πιο
διαδεδομϋνουσ τη γλυκουρονοξυλϊνη, την αραβινογλυκουρονοξυλϊνη, τη γλυκομαννϊνη,
την αραβινογαλακτϊνη, την ξυλογλυκϊνη και τη γαλακτογλυκομαννϊ
νη
[
Polizeli

et

al
.,
2005
].


23


1.2.
2
.
1

Ξυλϊνη


Η ξυλϊνη αποτελεύ το κυριϐτερο ςυςτατικϐ τησ ημικυτταρύνησ
[
Polizeli

et

al
.,
2005
]. Η δομό τησ παρουςιϊζει εξαιρετικό ποικιλομορφύα ανϊλογα με την πηγό
προϋλευςόσ τησ και τη φϊςη ανϊπτυξησ του φυτοϑ. Η δομό τησ ξυλϊνησ μπορεύ να εύναι
απϐ μια απλό, γραμμικό, μη υποκατεςτημϋνη αλυςύδα μορύων
D
-
ξυλοπυρ
ανϐζησ
ενωμϋνων μεταξϑ τουσ με
1,4
-
β
-
γλυκοζιτικοϑσ δεςμοϑσ, μϋχρι
ϋνα πολϑπλοκο ςϑμπλεγμα
ετεροπολυςακχαριτϔν με πολϑ υψηλϐ βαθμϐ διακλαδϔςεων. Οι ςακχαρικού
υποκαταςτϊτεσ ςυνδϋονται με τον κϑριο κορμϐ τησ ξυλϊνησ, μϋςω γλυκοζιτικϔν
δεςμϔν, ςτουσ ϊνθρακεσ 2 και 3 των ξυλανοπυρανοζϔν τησ. Η κ
ϑρια αλυςύδα ςυνόθωσ
εύναι υποκατεςτημϋνη ςε ποικύλο βαθμϐ απϐ μονϊδεσ μορύων 4
-
Ο
-
μεθυλ
-
α
-
D
-
γλυκουρονικοϑ οξϋοσ, α
-
D
-
γλυκουρονικοϑ οξϋοσ ό α
-
L
-
αραβινοφουρανοζϔν που ςε
μερικϋσ περιπτϔςεισ εύναι εςτεροποιημϋνεσ με ομϊδεσ οξικοϑ οξϋοσ. ΢ε οριςμϋνεσ
περιπτϔςεισ, υποκατεςτημϋνεσ μονϊδεσ α
-
L
-
αραβινοφουρανοζϔν μπορεύ να εύναι
εςτεροποιημϋνεσ με φαινο
λικϊ οξϋα. Σο φερουλικϐ και το
p
-
κουμαρικϐ οξϑ ςυνδϋονται
μϋςω εςτερικϔν δεςμϔν ςτον ϊνθρακα
C
(
O
)
-
5 τησ αραβινϐζησ
[
B
é
guin

&
Aubert
, 1994;

Uffen
, 1997]

Οι ξυ
λανάςεσ μποροφν να κατθγοριοποιθθοφν, με βάςθ τθ φφςθ των
υποκαταςτατών τθσ κφριασ αλυςίδασ, ςε πζντε οικογζνειεσ, τισ ομοξυλάνεσ, τισ
γλυκουρονοξυλάνεσ, τισ αραβινοξυλάνεσ, τισ αραβινογλυκουρονοξυλάνεσ και τισ
γλυκουρονοαραβινοξυλάνεσ.

Στον παρακάτω πίνακ
α παρουςιάηονται ςυγκεντρωτικά τα
χαρακτθριςτικά των πζντε τφπων πολυςακχαριτών που ςυνιςτοφν τισ πζντε οικογζνειεσ
ξυλανών
[
Saha
, 2003
].



Πίνακας

1.1
.

Τα χαρακτθριςτικ
ά των πζντε οικογενειών ξυλανών
[
Saha
, 2003
].




1.2.
3

Λιγνύνη


Η λιγνύνη εύναι ϋνα πολϑπλοκο, με υψηλϐ βαθμϐ διακλαδϔςεων, τριςδιϊςτατο,
αρωματικόσ φϑςησ πολυμερϋσ, προερχϐμενο απϐ μονομερό που ϋχουν ωσ βϊςη το
φαινυλοπροπϊνιο και διαφϋρουν ωσ προσ των αριθμϐ των ομϊδων μεθοξυλύου που
φϋρουν ςτον αρωματικϐ τουσ δακτϑλ
ιο
[
Kuhad

et

al
.
, 1997
;

Lee
, 1997;

Lagaert
, 2009
]. Σα
πολυμερό
αυτϊ ςυντύθενται απϐ τον ςυμπολυ
μεριςμϐ με μηχανιςμϐ ελευθϋρων ριζϔν

24


των
υδροξυκινναμυλικϔν αλκοολϔν (μονολιγνολϔν), δηλαδό τησ
p
-
κουμα
ρυλο
-
, τησ
κονιφε
ρυ
λο
-

και τησ ςινα
πυλο
-

αλκοϐλησ. Ο πολυμεριςμϐσ καταλϑεται απϐ
υπεροξειδϊςεσ
[
Lee
, 1997
].




Σχήμα
1.6
.

Σα
μονομερό, (Α
)
p
-
κουμαρυλο
-
, (Β) κονιφερυλο
-

και (Γ
) ςιναπυλο
-

αλκοϐλη,
απϐ τα οπούα ςυντύθενται τα μακρομϐρια τησ
λιγνύνησ
[
Doherty

et

al
., 2011
].


Μεταξϑ των δομικϔν
μονϊδων αναπτϑ
ςςονται δεςμού ϊνθρακα
-
ϊνθρακα
(
-
C
-
C
-
)
και αιθερικού δεςμού (
-
C
-
O
-
C
-
). Οι δεςμού ϊνθρακα
-
ϊνθρακα αναπτϑςςονται μεταξϑ
δακτυλύων

φαινυλοπροπανύου, μεταξϑ δϑο αλειφατικϔν αλυςύδων προπανύου ό μεταξϑ
αλειφατικόσ

αλυςύδασ κα
ι δακτυλύου. Οι αιθερι
κού δεςμού

αναπτϑςςονται μεταξϑ δϑο
υδροξυλύων
τησ
αλυςύδασ του προπανύου, μεταξϑ ενϐσ φαινολικοϑ και ενϐσ αλειφατικοϑ
υδροξυλύου και, τϋλοσ, ανϊμεςα ςε δϑο φαινολικϊ υδροξϑλια.

Η λιγνύνη ϋχει υψηλϐ βαθμϐ πολυμεριςμοϑ, ϊμορφη δομό και υδρϐφοβο
χαρακτόρα. Δ
ιαδραματύζει ςημαντικϐ ρϐλο ςτην εξαςφϊλιςη τησ δομικόσ ςταθερϐτητασ
του κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ
, εμποδύζει τη διεύςδυςη παθογϐνων μικροοργαν
ι
ςμϔν και
τα καθιςτϊ αδιαπϋραςτα απϐ το νερϐ
[
Kuhad

et

al
.
, 1997
]
. Η υδρϐλυςη

τησ λιγνύνησ
πραγματοποιεύται με επύδραςη αλκαλικοϑ ό ϐξινου διαλϑματοσ ςτη θερμοκραςιακό
περιοχό 150
-
180
o
C
.



1.3
Δομό του κυτταρικοϑ τοιχώματοσ


΢τα κυτταρικϊ τοιχϔματα των φυτικϔν κυττϊρων εύναι διακριτό η ςυνϑπαρξη
δϑο δομικϔν φϊςεων, τησ ςκελετικόσ

φϊςησ που δομεύται απϐ κυτταρύνη οργανωμϋνη
υπϐ μορφό μικροώνιδύων, και τησ ϊμορφησ φϊςησ, καλοϑμενη θεμελιϔδησ ουςύα ό
ςτρϔμα, η οπούα αποτελεύται απϐ γεμιςτικϊ υλικϊ (ημικυτταρύνεσ, πηκτινικϋσ ενϔςεισ
και γλυκο
πρωτεϏνεσ
) και χαρακτηρύζεται ωσ μια
ιςϐτροπη διογκοϑμενη πηκτό. Η
εναπϐθεςη των παραπϊνω ςυςτατικϔν δε γύνεται ομοιογενϔσ, τϐςο ςε επύπεδο δομόσ
ϐςο και χρονικϊ κατϊ τη βιογϋνεςη του κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ. Αντύθετα, η ςχετικό
ςυμβολό των ςυςτατικϔν αυτϔν καθϔσ και η αρχιτεκτονικό του τοιχϔμα
τοσ αλλϊζουν
μεταξϑ τριϔν διακριτϔν φϊςεων βιογϋνεςησ ςτισ οπούεσ ςχηματύζονται, κατ’
αντιςτοιχύα, τρύα διαφορετικϊ ςτρϔματα ςτα ϔριμα κυτταρικϊ τοιχϔματα.

Κατϊ την κυτταρικό αϑξηςη, τα νεοςχηματιζϐμενα κϑτταρα ενϐσ φυτικοϑ ιςτοϑ
ςχηματύζουν ϋνα λεπτϐ και
ςχετικϊ ευλϑγιςτο τούχωμα, το πρωτογενϋσ κυτταρικϐ
τούχωμα, η εξϋλιξη του οπούου ςυνδϋεται με τη διαφοροπούηςη του κυττϊρου το οπούο
περιβϊλλει. Η
δομό του πρωτογενοϑσ

κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ διαμορφϔνεται απϐ
μικροώνύδια κυτταρύνησ τα οπούα εύναι ενςωματωμϋ
να ςε μια ϊμορφη μότρα πρωτεώνϔν
και, ημικυτταρινικϔν και πηκτινικϔν πολυςακχαριτϔν [
P
é
rez

&

Samain
, 2010;

Sandhu

et

al
.
, 2009
]. Η δομό του κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ εκπληρϔνει δϑο φαινομενικϊ
αντιφατικοϑσ ρϐλουσ. Η κυτταρύνη προςδύδει ακαμψύα ςτο κυτταρικϐ το
ύχωμα,
ςυμβϊλλοντασ ςτη δομικό ακεραιϐτητα του κυττϊρου και ςτην αντοχό του ϋναντι τησ

25


πύεςησ ςπαργόσ που αναπτϑςςεται ςτο πλαςμϊλημμα. Οι ημικυτταρύνεσ και οι πηκτύνεσ,
απϐ την ϊλλη μεριϊ, προςδύδουν ςτο κυτταρικϐ τούχωμα ελαςτικϐτητα και
πλαςτικϐτητα προ
κειμϋνου να επιτρϋπει την κυτταρικό αϑξηςη [
P
é
rez

&

Samain
,
2010;

Sandhu

et

al
.
, 2009;
Anderson

et

al
.
, 2009;
Sila

et

al
., 2005
].

Η χημικό

ςϑςταςη του πρωτογενοϑσ κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ
ποικύλλει
ςημαντικϊ ανϊμεςα ςτουσ διϊφορουσ κυτταρικοϑσ τϑπουσ. Γενικϊ, ςτη ςϑςταςη του
πρωτογενοϑσ κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ κυριαρχοϑν ιδιαύτερα οι ημικυτταρύνεσ και οι
πηκτύνεσ με ποςοςτϊ 25
-
50% και 10
-
35% τησ ςυνολικόσ ξηρόσ μϊζασ, αντύςτοιχα, ενϔ
ϋνα μικρ
ϐτερο ποςοςτϐ, 9
-
25%, αποτελεύ η κυτταρύνη
[
Bidlack

et

al
., 1992
].

Μεταξϑ γειτονικϔν αναπτυςςϐμενων κυττϊρων ςχηματύζεται το μεςοτούχιο
(μϋςη πλϊκα), μια ςτοιβϊδα πηκτινικόσ ςϑςταςησ, η οπούα εξαςφαλύζει τη ςυγκϐλληςη
των κυττϊρων, ςυγκρατϔντασ τα ςε ϋναν ενιαύο ςχηματιςμϐ
[
P
é
rez

&

Samain
, 2010
].

΢ε οριςμϋνα κϑτταρα, αφοϑ

ολοκληρωθεύ η διαδικαςύα τησ αϑξηςησ,
διαμορφϔνεται ϋνα νϋο ϊκαμπτο τούχωμα, το δευτερογενϋσ κυτταρικϐ τούχωμα, εύτε με
πϊχυνςη του πρωτογενοϑσ τοιχϔματοσ εύτε με εναπϐθεςη νϋων ςτοιβϊδων
διαφορετικόσ ςϑςταςησ ςτισ προϒπϊρχουςεσ ςτοιβϊδεσ
[
Popper
, 2008
].

Η διϊταξη των
μικροώνιδύων κυτταρύνησ ςτο δευτερογενϋσ κυτταρικϐ τούχωμα χαρακτηρύζεται απϐ
μεγαλϑτερη κανονικϐτητα
[
Bidlack

et

al
., 1992
]. Η λιγνύνη εναποτύθεται ωσ ϋνα
επικαλυπτικϐ και προςτατευτικϐ υλικϐ ςτη μότρα κυτταρινϔν και ημικυτταρινϔν και
ςυνεις
φϋρει ςτη μηχανικό ενδυνϊμωςη των φυτικϔν ιςτϔν
[
P
é
rez

&

Samain
, 2010]
.
΢υχνϊ, το
δευτερογενϋσ κυτταρικϐ τούχωμα παρουςιϊζει ςτρωματοπούηςη ςτην
καταςκευό του
[
Kuhad

et

al
.
, 1997
]
. ΢τα κϑτταρα των ξυλωδϔν ιςτϔν, διακρύνονται
τρεισ επϊλληλεσ ςτοιβϊδεσ, ςε
κϊθε μια απϐ τισ οπούεσ, τα μικροώνύδια κυτταρύνησ
ςυγκροτοϑν πυκνϋσ διατϊξεισ με την ύδια διεϑθυνςη, αλλϊ διαφορετικό μεταξϑ
διαδοχικϔν ςτοιβϊδων [
Goodwin

&
Mercer
, 1983;

Bidlack

et

al
., 1992
].

Η κυτταρύνη καλϑπτει το μεγαλϑτερο μϋροσ τησ ςϑςταςησ του
δευτερογενοϑσ
κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ, με ποςοςτϐ 40
-
80% τησ ςυνολικόσ ξηρόσ μϊζασ, ενϔ η
ημικυτταρύνη και η λιγνύνη ςυνειςφϋρουν κατϊ 10
-
40% και 5
-
25%, αντύςτοιχα, ςτη
ςυνολικό ξηρό μϊζα του τοιχϔματ
οσ.

Οι ημικυτταρύνεσ ςυνδϋονται με την κυτταρύνη με δεςμοϑ
σ υδρογϐ
νου και με τη
λιγνύνη με ομοιοπ
ολικοϑσ δεςμοϑσ, λειτουργϔντασ ουςιαςτικϊ ωσ ςυνδετικϐσ ιςτϐσ
ανϊμεςα ςτην κυτταρύνη και τη λιγνύνη
,

ϋτςι ϔςτε να εξαςφαλύζεται η ςυνεκτικϐτητα
και η ακεραιϐτητα των κυτταρικϔν τοιχωμϊτων
[
Bidlack

et

al
., 1992
].




Σχήμα
1.7
.

΢χηματικϐ μοντϋλο ενϐσ τμόματοσ τυπικοϑ πρωτογενοϑσ κυτταρικοϑ τοιχϔματοσ
κατϐπιν εγκϊρςιασ τομόσ. Διακρύνονται τα μικροώνύδια κυτταρύνησ τα οπούα εύναι
εμβαπτιςμϋνα ςε μια ϊμορφη μότρα ημικυτταρινικϔν και πηκτινικϔν πολυςακχαριτϔν. Η
μϋςη πλϊκα

εύναι η ςτοιβϊδα που ςυγκολλϊ τα κυτταρικϊ τοιχϔμ
ατα γειτονικϔν φυτικϔν
κυττϊρων
[
Harris
, 2009
].


26


Κεφάλαιο
2

Ενζυμική υδρόλυςη λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζασ















2.1
Ενζυμικό υδρϐλυςη κυτταρύνησ


Η παρατόρηςη ϐτι κϊποιοι μικροοργανιςμού αποικοδομοϑν τη φυςικό κυτταρύνη,
ενϔ ϊλλοι μϐνο τα διαλυτϊ παρϊγωγϊ τησ οδόγηςε ςτη διατϑπωςη ενϐσ μοντϋλου
ςϑμφωνα με το οπούο η υδρϐλυςη τησ κυτταρύνησ λαμβϊνει χϔρα ςε δϑο διαδοχικϊ
ςτϊδια: ϋνα ενζυμικϐ ςϑςτημα,

C
1
, το οπούο δεν ϋχει υδρολυτικό δρϊςη, διαςπϊ την
κρυςταλλικό δομό τησ κυτταρύνησ, και ϋνα ςϑςτημα,
C
x
, που ϋπεται

τησ δρϊςησ του
πρϔτου
, καταλϑει την υδρϐλυςό
τησ
[
Reese

et

al
., 1950
]
.

Οι πρϔτεσ ςυςτηματικϋσ
μελϋτεσ
με αντικεύμενο την υδρϐλυ
ςη τησ
κυτταρύνησ αποςκοποϑςαν

ς
την κατανϐηςη
των αιτιϔν τησ αποςϑνθεςησ των κυτταρινοϑχων υλικϔν ςε τροπικϋσ ςυνθόκεσ. Έκτοτε,
ϋνασ μεγϊλοσ

αριθμϐσ ερευνητικϔν πειραμϊτων

ϋχει ςυνειςφϋρει ςτην
αποκρυπτογρϊφηςη τη
σ δομόσ και τησ λειτουργύασ των ενζυμικϔν
ςυςτημϊτων που
εμπλϋκονται ςτην υδρϐλυςη τησ
. Σο αρχικϐ μοντϋλο
C
1
/
C
x

αντικαταςτ
ϊθηκε απϐ το
μοντϋλο τησ ςυνεργατικόσ

δρϊςησ μιασ ομϊδασ τριϔν ενζϑμων που αποτελοϑν τισ
κυτταρινϊςεσ

[
Henrissat
, 1994
]
.

Οι κυτταρινϊςεσ παρϊγονται απϐ ϋνα ευρϑ ςϑνολο μικροοργ
ανιςμϔν που
περιλαμβϊνει, γενικϊ, μϋλη των επικρατειϔν βακτόρια και ευκϊρυα. Μεταξϑ των
ευβακτηρύων ςυναντϔνται κυρύωσ ςτισ τϊξεισ
Actinomycetales

(φϑ
λο
Actinobacteria
) και
Clostridiales

(
φϑ
λο
Firmicutes
), ενϔ ϐςον αφορϊ τα ευκϊρυα, η παρουςύα τουσ εύναι
διαδεδομϋνη ςε ϐλο το ταξινομικϐ ςχόμα του βαςιλεύου των μυκότων.

Παραγωγό
κυτταρινολυτικϔν ενζϑμων ϋχει αναφερθεύ, επύςησ, και απϐ οριςμϋνα ζωικϊ εύδη, ϐπωσ
οςτρακϐδερμα και τερμύτεσ, χωρύσ
ωςτϐςο
να ϋχει διαςαφηνιςτεύ ακϐμη ο ρϐλοσ αυτϔν
των ενζϑμων

[
Lyn
d

et

al
., 2002
].

Οι κυτταρινϊςεσ αποτελοϑν ϋνα πολυςϑνθετο ςϑςτημα τριϔν εξειδικευμϋνων
ενζυμικϔν δρϊςεων που ενεργοϑν ςυνεργιςτικϊ ςτη διαδικαςύα αποικοδϐμηςησ τησ
κυτταρύνησ: 1) η

ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςη
[
EG
,
3.2.1.4
]

προςβϊλλει τισ
μη κρυςταλλικϋσ
περιοχϋσ τησ κυτταρύνησ, υδρολϑοντασ τυχαύα εςωτερικοϑσ 1,4
-
β
-
D
-
γλυκοζιτικοϑσ

δεςμοϑσ και δημιουργϔντασ ελεϑ
θερα ϊκρα ςτισ αλυςύδεσ, 2) η ϋ
ξω
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςη
ό κελλοβιοϒδρολϊςη
[
CBH
,
EC

3.2.1.9
1
]

επενεργεύ ςε κρυςταλλικϋσ και
μ
η κρυςταλλικϋσ
περιοχϋσ απ
οκϐπτωντασ μονϊδεσ κελλοβιϐζησ απϐ τα αναγωγικϊ και μη αναγωγικϊ
ϊκρα των αλυςύδων κυτ
ταρύνησ και 3) η β
-
γλυκοζιδϊςη
[
CB
,
EC

3.2.1.21
]

υδρολϑει την
κελλοβιϐζη προσ
γλυκϐζη
[
Lynd

et

al
., 2002;
Tomme

et

al
., 1995
]
.

Οι διαδοχικϊ
εναλλϊςςοντεσ 1,4
-
β
-
γλυκοζιτικού δεςμού ςτο μϐριο τησ
κυτταρύνησ διαφϋρουν ωσ προσ
τη

ςτερεοχημεύα τουσ λϐγω τησ περιςτροφόσ κϊθε μονϊδασ γλυκϐζησ κατϊ 180
ο

ωσ
προσ
τα γειτονικϊ τησ μον
ομερό. Ωσ εκ τοϑτου, δϑο τϑπων ϋ
νδο
-
, ϋ
ξω
-

γλουκαναςϔν
και β
-

27


γλυκοζιδαςϔν
με διαφορετικό ςτερεο
ε
ξειδύκευςη

απαιτοϑνται για την υδρϐλυςη τησ
κυτταρύνησ
[
Brooks

et

al
., 1992
]
.

Η ςυνεργατικό δρϊςη των ενζϑμων αυτϔν εύναι κα
θοριςτικό για την
αποτελεςματικϐ αποπολυμεριςμϐ

τησ κυτταρύνησ. Η ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςη δρα ςτισ
ϊμορφεσ
περιοχϋσ των αλυςύδων
, απελευθερϔνοντασ θραϑςματα, ςτα ελεϑθερα ϊκρα
των οπούων μπορεύ να επενεργόςει μετϋπειτα η κελλοβιοϒδρολϊςη για την περαιτϋρω
υδρϐλυςη τησ κυτταρύνησ
[
S
á
nchez
, 2009
].

Σα μϐρια κελλοβιϐζησ που παρϊγονται απ
ϐ
τη δρϊςη τησ κελλοβιοϒδρολϊςησ τελικϊ υδρολϑονται απϐ τη β
-
γλυκο
ζιδϊςη προσ
γλυκϐζη.
Η δρϊςη τησ β
-
γλυκοζιδϊςησ εύναι,
επύςησ, ςημαντικό

ςτην ϐλη διεργαςύα
αποικοδϐμηςησ τησ κυτταρύνησ καθϔσ η ςυςςϔρευςη κε
λλοβιϐζησ παρεμποδύζει τη
ςϑνθε
ςη των ϋ
νδο
-

κα
ι
ϋ
ξω
-

γλουκαναςϔν λϐγω αναςτολόσ απϐ
ανϊδρομη
τροφοδϐτηςη
[
Kumar

et

al
., 2008
].

Πρωταρχικϐ ςημεύο για την εκκύνηςη τησ υδρολυτικόσ διαδικαςύασ, ςτο γενικϐ
μοντϋλο υδρϐλυςησ τησ κυτταρύνησ, αποτελεύ η προςρϐφηςη των κυτταριναςϔν ςτην
επιφϊνεια
του κυτταρινοϑχου
υποςτρϔματοσ
[
Maa

et

al
., 2008
]. ΢τη

ςυνϋχεια,
πραγματοποιεύται εντοπιςμϐσ του προσ υδρϐλυςη δεςμοϑ κ
αι ςχηματύζεται το ςϑμπλοκο
ενζ
ϑμου
-
υποςτρϔματοσ
[
Bansal

et

al
., 2009
].
Λϐγω

τησ αδιϊλυτησ φϑςησ
του
υποςτρϔματοσ, οι ϋνδο
-

και ϋ
ξω
-

γλουκανϊςεσ καταλϑουν την υδρϐλυςη τησ κυτταρύνησ
ςτη διεπιφϊνει
α υγροϑ
-
ςτερεοϑ, ενϔ η β
-
γλυκοζι
δϊςη καταλϑει την υδρϐλυςη των
διαλυτϔν προώϐντων που προκϑπτουν απϐ τισ προηγοϑμενεσ ενζυμικϋσ
δρϊςεισ [
Yeoman

et

al
., 2010
].

Σϋλοσ
, μετϊ την υδρϐλυςη του
γλυκοζιτικοϑ δεςμοϑ διενεργεύται
διολύςθηςη των κυτταριναςϔν κατϊ μόκοσ των μακρομοριακϔν αλυςύδων τησ
κυτταρύνησ προσ το
ν εντοπιςμϐ και τη ςυνακϐλουθη

υδρϐλυςη επ
ϐμενου δεςμοϑ

[
Bansal

et

al
., 2009
].




Σχήμα
2.1
.

Απεικϐνιςη των ενζυμικϔν δρϊςεων που
εμπλϋκονται ςτην υδρϐλυςη τησ
κυτταρύνησ. Οι ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςεσ υδρουλϑουν τυχαύα εςωτερικοϑσ 1,4
-
β
-
γλυκοζιτικοϑσ δεςμοϑσ. Η ϋνδο
-
1,4
-
β
-
D
-
γλουκανϊςη ό κελλοβιοϒδρολϊςη αποςπϊ μονϊδεσ
κελλοβιϐζησ απϐ τα αναγωγικϊ και μη αναγωγικϊ ϊκρα των αλυςύδων κυτ
ταρύνησ. Η
κελλοβιϐζη, εν ςυνεχεύα, υδρολϑεται προσ γλυκϐζη απϐ τη β
-
γλυκοζιδϊςη [
Yeoman

et

al
.,
2010
].


28


2.1.1
Θϋςη κυτταριναςών ςτο ταξινομικϐ ςχόμα των ενζϑμων


Η ςυςτηματικό ταξινϐμηςη και ο προςδιοριςμϐσ των ενζϑμων πραγματοποιεύται
με βϊςη τη φϑςη των

χημικϔν αντιδρϊςεων που καταλϑουν, ϐπωσ ορύζεται απϐ τισ
κατευθυντόριεσ γραμμϋσ τησ Διεθνοϑσ Ένωςησ Βιοχημεύασ και Μοριακόσ Βιολογύασ
(
IUBMB
). ΢ε αυτϐ το ςϑςτημα ταξινϐμηςησ, τα ϋνζυμα

κατατϊςςονται ςε ϋξι τϊξεισ

με
βϊςη την εξειδύκευςη τησ αντύδραςησ,
εν
ϔ η υποδιαύρεςη των τϊξεων ςε υποτϊξεισ

και η
περεταύρ
ω διχοτομόςεισ των υποτϊξεων υποδεικνϑουν

πιο ςυγκεκριμϋνα τον τϑπο τησ
αντύδραςησ. Κϊθε ϋνζυμο φϋρει ϋνα ςυςτηματικϐ ϐνομα και ϋναν ςυςτηματικϐ αριθμϐ. Ο
ςυςτηματικϐσ αριθμϐσ αποτελεύ μια κωδικοπούηςη
ϐπου τα κεφαλαύα γρϊμματα
EC

(
Enzyme

Comission
) ακολουθοϑνται απϐ αριθμοϑσ χωριςμϋνουσ με ςημεύα, οι οπούοι
βρύςκονται ςε κατϊ ςε
ιρϊ αντιςτοιχύα με την τϊξη, υποτϊξη, υπο
-
υποτϊξη

και τον
αριθμϐ ςειρϊσ
του εκϊςτοτε ενζϑμου. ΢το ςϑςτημα αυτϐ, οι κυτταρινϊ
ςεσ

κατατϊςςονται ςτην υποτϊξη

των γλυκοςιδαςϔν, ο οπούεσ υ
πϊγονται ςτην ευρϑτερη
τϊξη

των υδρολαςϔν. Ωςτϐςο, το ςϑςτημα αυτϐ δεν λαμβϊνει υπϐψη πληροφορύεσ
ςχετικϋσ με την τριςδιϊςτα
τ
η δομό των ενζϑμων και ενϋχει τ
η
ν εγγενό αδυναμύα
προςδιοριςμοϑ διαφορετικϔ
ν ενζϑμων που καταλϑουν την ύδια αντύδραςη.

Η τρϊπεζα δεδομϋνων
Cazy

(
Carbohydrate

Active

enZYmes
) αποτελεύ ϋνα
ςϑςτημα κατηγοριοπ
ο
ύη
ςησ των ενζϑμων που
υιοθετεύ

ωσ κριτόριο ταξινϐμηςησ την
πρωτοτ
αγό τουσ δομό, καθϔσ τϐςο τα

δομικϊ χαρακτηριςτικϊ
, ϐςο και
οι καταλυτικού
μηχανιςμού ςχετύζονται ϊμεςα με την αμινοξικό ακολουθύα.
Έτςι, τα ϋνζυμα τησ ύδιασ
οικογϋνειασ εμφανύζουν παρϐμοια τριτοταγό δομό και παρϐμοιουσ καταλυτικοϑσ
μηχανιςμοϑσ.
΢το ςϑςτημα αυτϐ, ϋχουν καταχωρηθεύ περιςςϐτερεσ απϐ 100 οικογϋνειεσ
γλυκοςιδαςϔν με τα κυτταριν
ολυτικϊ ϋνζυμα να αποτελοϑν μϋλ
η των οικογενειϔν: 1, 3,
5, 6, 7, 9, 10, 16, 44, 45, 48, 51,
61, 74
[
Henrissat

&
Bairoch
, 1996;

Lynd

et

al
., 2002
].



2.1.2
Μοριακό δομό κυτταριναςών


Η δομό των κυτταριναςϔν αποτελεύται απϐ δϑο
υπομονϊδεσ, την καταλυτικό
υπομονϊδα (
Catalytic

Domain
,
CD
) η οπούα εύναι υπεϑθυνη για την υδρολυτικό
αντύδραςη και τ
η
ν υπομονϊδα πρϐςδεςησ ςακχϊρων (
Carbohydrate

Binding

Domain
,
CBD
), η οπούα διατηρεύ προςδεδεμϋνη την καταλυτικό υπομονϊδα ςτην αλυςύδα
κυτ
ταρύνησ κατϊ τη διϊρκεια τησ υδρϐλυςησ.

Η αναγνϔριςη
των πολυςακχαριτϔν απϐ
την υπομονϊδα πρϐςδεςησ ςακχϊρων
και
η αλληλεπύδραςη μαζύ τουσ

οφεύλεται ςε
αρωματικϊ αμινοξϋα που εντοπύζονται ςτισ θϋςεισ πρϐςδεςησ.

Μια βραχεύα πεπτιδικό
αλυςύδα
, ςυνόθωσ πλοϑςι
α ςε προλύνη, ςερύνη και θρεονύνη,

ςυνδϋει τισ υπομονϊδεσ
εξαςφαλύζοντασ τη λειτουργικϐτητϊ
τουσ
[
Henrissat
, 1994;

Henriksson

et

al
., 1999;

Yeoman

et

al
., 2010
;
Singh

et

al
., 1990
].



Σχήμα
2.2
.

Συπικό δομό μιασ κυτταρινϊςησ. Διακρύνονται η καταλυτικό
υπομονϊδα (
CD
) και
η υπομονϊδα πρϐςδεςησ ςακχϊρων (
CBD
).
Σα εξϊγωνα αντιπροςωπεϑουν τα αρωματικϊ
αμινοξϋα που εντοπύζονται ςτισ θϋςεισ πρϐςδεςησ και ευθϑνονται για τισ αλληλεπιδρϊςεισ με
τα ςϊκχαρα που ςυνιςτοϑν τισ αλυςύδεσ κυτταρύνησ. Σο βϋλοσ
υποδεικνϑει το ενεργϐ κϋντρο

[
Hilde
´ &
Johansson
, 2004
].


29


Οι κυτταρινϊςεσ που ανόκουν ςτην ύδια οικογϋνεια επιδεικνϑουν παρϐμοια
τριτοταγό δομό, ϐπωσ αποδεικνϑεται με βϊςη τα δεδομϋνα κρυςταλλογραφύασ ακτύνων
X
. Εντοϑτοισ, η ενδελεχόσ μελϋτη και ςϑγκριςη τω
ν τριτοταγϔν δομϔν των πρωτεώνϔν
κατϋδειξε ϐτι ϋνζυμα διαφορετικϔν οικογενειϔν χαρακτηρύζονται απϐ παρϐμοια
πρωτεώνικό αναδύπλωςη, παρϋχοντασ ενδεύξεισ για την πιθανό προϋλευςη αυτϔν των
ενζϑμων απϐ το ύδιο προγονικϐ πρωτεώνικϐ μϐριο. Σα ϋνζυμα αυτϊ κατατϊ