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Publié le: 2013-09-30
Multiplication végétative in vitro de la Tanaise annuelle du Maroc: Tanacetum annuum (L.)In vitro propagation of the annual tansy of Morocco: Tanacetum annuum (L.)
Auteur(s) :HARRAS Naima et LAMARTI Ahmed
Catégorie : Environnement > Biologie
ScienceLib Editions Mersenne : Volume 5 , N ° 130914ISSN 2111-4706
www.sciencelib.fr

Multiplication végétative in vitro de la Tanaise annuelle du Maroc:
Tanacetum annuum (L.)
In vitro propagation of

the annual tansy of Morocco: Tanacetum annuum
(L.)
HARRAS Naima
(1)
et LAMARTI Ahmed
(1)

(1)
Laboratoire de Biotechnologie et d'Amélioration des plantes, Département de
Biologie, Faculté des Sciences M’hannech II, BP 2121 Tétouan, 93002 Maroc.
(1)
harrasnaima@hotmail.fr
RESUME

Dans le but de la conservation des ressources naturelles et de la valorisation des plantes
aromatiques et médicinales au Maroc, La multiplication végétative in vitro de Tanacetum
annum L. a été mise au point. Les akènes sont d’abord mis à germer en conditions stériles
dans le milieu Gautheret (1959) et 1% d’AG3.
Les plantules cotylédonaires issues de la germination sont mises en culture sur
macroéléments du milieu SD contenant les microéléments de Murashige et Skoog additionné
de 30 g/l de saccharose, vitamines et Fe-EDTA de MS (1962) sans régulateurs de croissance.
Cet article présente les premiers résultats obtenus à notre connaissance sur la
multiplication végétative in vitro de l’espèce. D’ores et déjà, la méthode permet d’obtenir des
vitroplants pour des expériences de sélection précoce in vitro et pour des tests de cytokinines
et auxines sur la micropropagation et l’enracinement de cette espèce.
Mots-clés
: T. annuum L., Culture in vitro, Micropropagation, plantules cotylédonaires.
ABSTRACT

In the aim of the conservation of the natural resources and valorization of the aromatic
and medicinal plants in Morocco, a micropropagation of T. annuum L has been developed.
The seeds are first germinated in sterile conditions in the medium Gautheret (1959) and 1%
AG
3
.Cotyledonary seedlings after germination were cultured on SD macroelements
containing micrelements of Murashige and Skoog and supplemented with 30 g/l saccharose,
vitamins, Fe-EDTA of MS (1962) without growth regulators.

This article presents the first results of our knowledge in micropropagation vegetative of
T. annuum. Already, the method allows obtaining plantlets for early experiments in vitro
selection and testing of cytokinin and auxin on micropropagation and rooting of this species.
Key words
: T. annuum L., in vitro Culture, Micropropagation.
INTRODUCTION

Le présent travail a été réalisé au sein de l’Unité de Biotechnologie et d’Amélioration des
Plantes du Département de Biologie de la Faculté des Sciences de Tétouan de l’Université
Abdelmalek Essaâdi, il s’inscrit dans le cadre de la conservation, la sélection, et la
valorisation du potentiel naturel des plantes aromatiques et médicinales. Ainsi, nous nous
sommes intéressés à la multiplication végétative par culture in vitro (micropropagation) de la
camomille bleue du Maroc :
Tanacetum annuum L. qui
est une plante annuelle spontanée.
Le nom Tanacetum est dérivé du nom grec thanatos (thanatos = la mort). Ce nom est
référencé aux qualités médicinales du Tanacetum, à son odeur forte dite parfum éternel, et ses
utilisations en préservation, comme son utilisation pour embaumer les morts (Mitich, 1992).
Tanacetum annuum L. est une plante aromatique médicinale appartenant à la famille des
Composées ou Astéraceae Coste (1937). Elle est connue sous différents noms: Tanacetum
annuum L., Camomille bleue du Maroc, Tanaisie bleue, Tansy blue…
Divers remèdes contenant des espèces de Tanacetum ont été employées dans la médecine
traditionnelle depuis l’Antiquité, Le Tanacetum est utilisé comme antihelminthique (Goren et
al. 2002), antihistaminique (Schnaubelt, 2005), été employée pour des usages externes, pour
les maladies de peau et pour éclairer le visage des taches de rousseur et comme ingrédient en
parfums et colorants (Mitich, 1992), parfois le Tanacetum a été cultivé comme plante
ornementale dans quelques secteurs (Heywood 1976).
Les dépressions des plaines argileuses lourdes inondées en hiver constituent son habitat
écologique. La plante est répandue dans le Rif occidental : Région de Larache, Assilah,
Tanger, Tétouan, l’aire géographique de l’espèce: Nord du Maroc, les montagnes du sud de
l'Espagne, le Portugal, et la France méridionale (Coste, 1937 ; Jahandiez, 1934).
Les travaux de recherche étudiant les constituants volatils de la Tanaisie annuelle sont
peu nombreux. Benjilali et al. (1989) et Barrero et al. (1992), qui ont fractionné 28 g d’HE
des fleurs de T. annuum sur gel de silice. La composition chimique de l’huile essentielle a été
réalisée à partir d’un chromatogramme sur une colonne capillaire SE 54, 71 composés ont été
répertoriés et quantifiés dans les différents échantillons analysés : 47 constituants ont été
identifiés dont 26 ont déjà été signalés par Benjilali et al. (1989). Le chamazulène est le
constituant majoritaire ; la teneur de cet hydrocarbure sesquiterpénique varie de 17 à 38 %.
Des études précédentes sur la composition chimique et les propriétés antifongiques des
pousses de Tanacetum annuum, montrent que le sabinène (22,3 %) et le camphre (13,2 %)
sont des constituants prédominants (Greche et al. 2000).

La multiplication végétative in vitro apporte un progrès considérable par rapport aux
méthodes traditionnelles, avec un taux de multiplication de 100 à 1000 fois plus élevé, elle
permet un clonage des espèces car elle constitue un moyen de reproduire d’une manière
asexuée une plante identique à elle-même et de constituer une population d’individus tous
semblables que l’on appelle un clone (Duhoux, 1988).
La culture in vitro des plantes est une méthode alternative des méthodes traditionnelles,
pour une production commerciale durable (George et Sherrington, 1984), ainsi il offre une
provision contrôlée de substances biochimiques indépendantes de disponibilité des plantes et
la qualité de produit plus cohérente par l’industrie pharmaceutique (Nalawade et Tsay., 2004).
La propagation in vitro des plantes par l’intermédiaire des cultures des tissus est nommé
micropropagation (George et al., 2008). Actuellement cette technique est utilisée largement
pour la production commerciale d’un grand nombre d’espèces de plantes, y compris beaucoup
de plantes médicinales (Shimomura et al.,1997 ; Rout et al., 2000 ; Amin et al., 2003), pour
objectif la multiplication des clones à grande échelle.
La régénération de divers plantes médicinales dont la camomille via la culture in vitro
s’effectue généralement à partir des bourgeons apicaux ou axillaires obtenus à partir de la
germination in vitro des graines ou à partir de segments nodaux excisés de plantes provenant
du champ, cette micropropagation s’effectue généralement sur le milieu Murashige et Skoog
(1962), qui permet d’obtenir un pourcentage de pousses plus élevé (Fauconnier et al., 1996 ;
Asai et al .,1995 ;Maday et al., 2000 et Echeverrigaray et al., 2000).
Les objectifs spécifiques de ce travail sont :
 Mettre au point une technique de régénération in vitro d’espèce précitée en étudiant
l’effet des macroéléments et des régulateurs de croissance sur la croissance et le
développement des explants.
 Maîtriser les techniques de la culture in vitro de tanacetum annuum
 Propager tanacetum annuum via la culture in vitro.
Matériel végétal :

Les akènes de Tanacetum annuum L., ont été fournis par l’Institut National de la Recherche
Agronomique (INRA) de Rabat.
Les akènes sont préalablement triés et débarrassés du reste des capitules. Ils sont rangés dans
des sachets en plastique transparent et stockés à l’obscurité et à la température ambiante
.
Germination des akènes


Stérilisation des graines

La stérilisation s’est effectuée selon le protocole suivant : les akènes ont été stérilisés 15
minutes dans une solution filtrée 7 % (p/v) d'hypochlorite de calcium d'environ 120 degrés
chlorométriques français avec quelques gouttes de Tween 80 puis 2 minutes dans une solution
aqueuse de chlorure de mercure (HgCl
2
) à 0,1 %. Ils ont ensuite été rincés 3 fois (5,10 et 15
minutes) à l’eau distillée stérile.
 Mise en germination
• Effet des macroéléments sur la germination
Le délai, la vitesse et le pourcentage de germination sont variables chez les akènes de
Tanacetum annuum L. Afin d'obtenir un développement homogène des plantules, la
germination a été effectuée à la lumière sur les milieux minéraux Gautheret (1959),
Murashige et Skoog (1962), Shah et Dalal (1980), Schenk et Hildebrandt (1972), Gamborg
(1968) et White (1943) dans des boîtes de Petri stériles à raison de 5 akènes par boîte
contenant 30 ml du milieu solidifié par 0,7 % d’agar bactériologique type E (pH 5,8),
préalablement autoclavé pendant 20 min à 120°C.
• Effet de l’acide gibbérellique sur la germination
Dans l’espoir d’augmenter le taux de germination des akènes de Tanacetum annuum L.
les graines ont été imbibées dans différents concentrations d’acides gibbérelliques AG
3
(0;
0,8; 0,9 ; 1; 1,1 et 1,2 mg/L) pendant 15h après elles sont mises en germination dans le
macroélément de Gautheret (1959) à raison de 5 akènes par boîte de Pétri.

Les boites sont fermées et ont été placées dans une chambre climatisée à 24 ±1°C, 80 %
d’humidité relative, pourvue de tubes ″Philips-20 et 40W″ assurant un éclairement de 2,5
W.m
-2
(environ 2000 lux). La photopériode est de 18 heures de lumière pour 6 heures
d’obscurité.
Tableau : Macroéléments de Gautheret (1959).

Macroéléments

mg/l mM
KNO
3

MgSO
4
, 7 H
2
O
KH
2
PO
4

Ca(NO
3
)
2
, 4 H
2
O

125
125
125
500

1,24
0,51
0,92
2,12


Tableau: Macroéléments de White (1943)
Macroéléments
WH (1968)

mg/l

mM


KNO
3

Ca(NO
3
)
2
,4H
2
O
MgSO
4,
7H
2
O
NaH
2
PO
4,
H
2
O
Na
2
SO
4

KCl
80

288
737
16,5
200
65
0,79

1,22
2,98
0,12
1,40
0,87



Tableau: Macroéléments MS : Murashige et Skoog (1962)
Macroéléments

mg

/l

mM

NH
4
NO
3

KNO
3

MgSO
4
, 7H
2
O
KH
2
PO
2

CaCL
2
, 2H
2
O
1650

1900
370
170
440
20,60

18,80
1,50
1,25
3,00

Tableau : Macroéléments du milieu SD (Sahah et Dalal 1980)
Macroéléments

mg

/l

mM

NH
4
NO
3

KNO
3

CaCL
2
, 2H
2
O
MgSO
4
, 7H
2
O
KH
2
PO
2


500

1000
530
614
100
6,25

9,89
3,60
2,49
0,73

Tableau: les macroéléments du milieu SH (Schenk et Hildebrandt, 1972).
Macroéléments


mg/l mM
CaCl
2
.2H
2
O

MgSO
4
.7H
2
O
KNO
3

(NH
4
)
2
SO
4

200

399,24
2500
300

1,62

1,64
24,73
2,61
Tableau 8
: Les macroéléments du milieu Gamborg et Eveleigh (1968)
Macroéléments

mg/l

mM

CaCl
2
2H
2
O

MgSO
4
7H
2
O
KNO
3

(NH
4
)
2
SO
4

NaH
2
PO
4,
H
2
O
150

500
3000
134
150
1,02

2,04
29,76
1,01
1,08

Tableau: Microéléments du milieu MS (1962)

Microéléments


mg /l

mM
CoCl2, 6H2O

CuSO4, 5H2O
H3BO3
KI
MnSO4, H2O
Na2MoO4,2H2O
ZnSO4, 7H2O
Na2EDTA
FeSO4, 7H2O
0,025

0,025
6,2
0,83
16,9
0,25
8,6
37,3
27,8

0,11

0,1
100
5
100
1,03
29,91
100
00





Tableau : Vitamines et sucres du milieu MS (1962)
Vitamines

mg

/l

mM

Glycine

Thiamine-
HCl

Acide nicotinique

Pyridoxine-HCl
2,00

0,10
0,50
0,50
26,64

0,30
4,06
2,43
Sucres

mg

/l

mM

myo
-
Inositol

Saccharose
100

3000
555

8,76.10
4


 Culture d’apex

• Effet de la solution minérale sur le développement des apex
Les solutions des macroéléments des milieux Murashige et Skoog(1962), Shah et Dalal
(1980), SChenk et Hildebrandt (1972), Gamborg (1968) et Badoc(1982) (Tableau) auxquels
on a additionné les microéléments et les vitamines de Murashige et Skoog (1962), 30 g/l de
saccharose et 100 mg/l de myoinositol ont été testées sur les apex de Tanacetum annuum L.
Ces macroéléments diffèrent par leur teneur en azote (NO
-
3
et NH
4
+
) et en potassium
(Tableau). La culture a été réalisée dans des tubes à essai contenant 15ml du milieu gélosé.
Les milieux de culture sont ajustés à pH 5,8, additionnés d’agar (7 g/l), et autoclavés à 120 °C
pendant 20 minutes, les tubes ont été placés dans une chambre climatisée à 24 ±1°C, 80%
d’humidité relative, pourvue de tubes ″Philips-20 et 40W″ assurant un éclairement de 2,5
W.m
-2
(environ 2000 lux). La photopériode est de 18 heures de lumière pour 6 heures
d’obscurité.
Après une période de 30 jours les résultats obtenus qui sont le nombre des feuilles, des
bourgeons, des racines et la longueur des explants ont été analysés statistiquement par le test
ANOVA (analyse de variance) et l’analyse des moyennes a été analysé par le test de Duncan
de multiple classe au seuil de signification α=0,05.

Tableau: Composition ionique en mEq/l des 5 solutions de macroéléments testées.

















RESULTATS ET DISCUSSION

Germination in vitro
Effet des macroéléments sur la germination

Le protocole de stérilisation retenu utilisé diminue le taux de contamination de 30 à
12%. Pourtant la contamination n’est pas éliminée totalement, Ce problème existe chez toute
la famille des astéracées car les graines sont sauvages.
Milieux

MS

(1962)

B5

(1968)

SH

(1972)

SD

(1980)

MSm

(1982)

Cations







Mg
++

Ca
++

NH
+4

K
+

Na
+

3,0

6,0
20,6
20,0

2,0

2,0
2,0
24,7
1,1
3,2

2,7
2,6
24,7

5,0

7,2
6,2
10,6

1,5

3,0
3,4
10,0

Anions







SO4
--

Cl
-

NO3
-

H2PO4
-

3,0

6,0
39,4
1,2
4,1

2,0
24,7
1,1
3,2

2,7
24,7
2,6
5,0

7,2
16,1
0,7
1,5

3,0
12,8
0,6
Azote total

60,0

27,8

27,6

22,4

16,25


Ions totaux
(mEq/l)

99,3

63,8

66,6

58,1

35,8

La germination des akènes de T.annuum L. a été réalisée sur les différents milieux,
Gautheret (1959), MS (1962), SD (1980), SH (1972), B5 (1968), Badoc (1982) et l’eau
gélosée. Les résultats des graines germées sont illustrés dans la figure:
Figure
: Effet de la composition des milieux testés sur la germination de T. annuum L.

On remarque que les courbes de germination sont divisées en trois phases :
• La phase de latence : c’est le temps entre le début de l’expérience jusqu’à la sortie de
la radicule.
• La phase exponentielle : le jour maximal, c'est-à-dire dès la sortie de la radicule
maximum de germination.
• La phase stationnaire dans laquelle le taux de germination devient stable.

Les akènes de T. annuum L. présentent un pourcentage variable de germination, il est étalé
sur 15 jours. La germination ne commence qu’à partir du quatrième jour après la mise en
germination dans tous les milieux testés.
La vitesse de germination des akènes de T. annuum L .s’est avérée meilleure sur le milieu
Gautheret (1959) (54%) que sur le milieu SD (50%).
Par contre, dans les autres milieux (MS, B5, Badoc et eau gélosée), le taux maximum est
atteint plus tardivement avec des valeurs moins importantes variant de 10 à 43%.
Cette différence dans les résultats peut s’expliquer par la différence dans les
compositions des milieux et le comportement de l’espèce vis-à-vis des solutions nutritives.



0
10
20
30
40
50
60
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

% de germination
jours
GAUTH

B5

SH

SD

MS

White

EAU DIST


Effet de l’acide gibbérellique sur la germination
Afin d’améliorer la germination des akènes, un prétraitement avec l’acide gibbérellique (AG
3
)
à différentes concentrations a été réalisé
.
Le résultat du suivi est représenté sur la figure
suivante :

Figure
: Effet de l’acide gibbérellique sur la germination des akènes de T. annuum L.

La courbe montre l’effet d’un prétraitement par l’AG
3,
pendant 15h, sur le taux de
germination. La présence d’acide gibbérellique à différentes concentrations prouve un effet
sur la germination des akènes en comparaison avec les macroéléments des Gautheret sans
AG
3
.
Après le traitement par l’acide gibbérellique à différentes concentrations, le pourcentage ainsi
que le temps de germination est changé. en effet on remarque que plus la concentration d’AG
3

augmente, plus le taux de germination diminue, ainsi le meilleur taux de germination (60%)
est obtenu suite au traitement par AG
3
à 1%.
Après la mise en germination des akènes traités par AG
3
à différentes concentrations, on
remarque que la germination commence dès le deuxième jour au lieu du troisième jour.
Le meilleur taux de germination est obtenu avec 1% d’AG3. Les résultats obtenus
montrent que le taux et la durée de germination varie selon le milieu utilisé, ainsi les meilleurs
résultats ont été obtenus sur les milieux Gautheret (1959) et Shah et Dalal (1980). Cette
différence dans les résultats peut s’expliquer par la différence dans les compositions des
milieux et le comportement de l’espèce vis-à-vis des solutions nutritives.
Les graines prétraitées avec l’acide gibbérellique montrent une différence dans le taux
de germination, en comparaison avec le milieu Gautheret sans AG
3
.
%

J

L’effet de l’AG
3
peut s’expliquer par le fait qu’il lève la dormance et déclenche le
processus physiologique de germination. Les résultats sont en accord avec ceux de Chen
(2006), qui a étudié l’effet de l’AG
3
sur la germination de Lychnis Senno.
Culture d’apex

• Effet de la solution minérale sur les caractères organogénèse
Les macroéléments des milieux suivants, MS, SD, SH, B
5
et Badoc, ont été testé sur la culture
d’apex des explants de T.annuum L. Les résultats obtenus sont enregistrés dans le tableau
suivant.


Tableau
: Effet des macroéléments de MS, SD, SH, B
5
et Badoc sur la multiplication, la
croissance, l’enracinement des bourgeons et la callognèse de T.annuum (L
.)

Les valeurs avec les mêmes lettres ne présentent pas une différence significative au seuil de 5%.
Les solutions minérales utilisées ont donné des résultats différents sur la formation des
feuilles, le taux de bourgeonnement, l’enracinement ainsi que le prolongement des pousses.
Les résultats obtenus ont montré que les macroéléments de SD sont les plus favorables en
comparaison avec d’autres macroéléments, (Photos 1, 2, 3, 4 et 5).
Milieu

Nombre
moyen des
feuilles
Nombre moyen
des racines
Longueur moyenne
des pousses (cm)
Nombre moyen
des bourgeons
MS

3,97±0,29
b

1.10 ± 0.10
b

1,25±0,08
b

1,03± 0,08
d


MS+ kin

3.93± 0.65

b

00 ± 00

1,21 ± 0,19
b

2,82± 0,49
b


SH

4.07 ± 0.52
b

0.5 ± 0.12
c

1,58± 0,21

b

2,53± 0,34
b


SH+ kin

3.96 ± 0.52
b

0.59 ± 0.18

a

1,04± 0,15
b

2,02± 0,33
b


B5

4.07 ± 0.29
b

1.40 ± 0.15
b

1,37±0,07
b

1,87± 0,12
bc


B5 + Kin

3.69 ± 0.54
b

0.24 ± 0.13bc

0,91± 0,14
b

1,65± 0,24
b

Badoc

4.33 ± 0.15
b

1.40± 0.92
b

1,41±0,08
b

1,26± 0,11
cd


Badoc +
kin

4.20 ± 0.64
b

0.76 ±0,20
a

1,41± 0,24
b

2,89±0,49
b


SD

9.13± 0.23
a

2.5 ± 0.17
a

2,69± 0,20
a

5,53± 0,38
a


SD+ Kin

7.38 ± 0.69
a

0.27 ± 0.15
bc

2,23± 0,19
a

4,59± 0,53
a

Les plantules ont manifesté un comportement très satisfaisant avec un nombre de
bourgeons et de racines adéquates, un aspect normal et une taille convenable, nos résultats
sont différents par rapport à ceux obtenus par des chercheurs tels qu’Akef et al. (2005), Rateb
et al.,(2007) qui ont cultivé des explants de T. parthenium dans le milieu MS. Keskitalo et al.
(1995) a établi La culture in vitro de T.vulgarie dans le milieu MS.
La différence est attribuée à la composition ionique des milieux. Certes l’analyse
ionique montre que le milieu MS est caractérisé principalement par une forte teneur en azote
(60 méq/l) dont 1/3 est apporté sous forme réduite (ions NH
4
+
) et par une concentration
également élevée en potassium (20 méq/l). Cependant la teneur en azote total est de 22,4
méq/l dans le milieu SD, avec une faible teneur en NH
4
+
(6,2 méq/l), dans ce cas, on peut dire
que l’espèce n’assimile pas trop d’azote.

• Effet des macroéléments sur la callogenèse
Les macroéléments des milieux suivants, MS, SD, SH, B
5
et Badoc, ont été testés sur
les explants de T.annuum L. Les résultats obtenus sont enregistrés dans la figure
suivante:


Figure
: Effet des macroéléments sur l’induction des cals chez le T.annuum L.

0
20
40
60
80
100
120
% du callogenése

Milieux
Les macroéléments des solutions utilisées sans Kinétine dans les milieux SD et Badoc
n’induit pas l’hyperhydrie et la callogenèse. Par contre en présence de Kinétine, on note un
pourcentage élevé des cals qui atteint 100% dans tous les milieux
Ainsi, les macroéléments du milieu Shah et Dalal ont donc été retenus pour des tests
expérimentaux de cytokinines et auxines sur la micropropagation et l’enracinement de cette
espèce.






















Photo 2

: Plantules de 30 jours
issues de la culture d’apex de
T.annuum L. dans le milieu SD.

Photo 4

: Plantules de 30 jours issues
de la culture d’apex de T .annuum L.
dans le milieu Badoc.

Photo 3

: Plantules de 30 jours issues
de la culture d’apex de T.annuum L.
dans le milieu SH.

Photo 1

: Plantules de 30 jours
issues de la culture d’apex de
T.annuum L. sur milieu MS.












BIBLIOGRAPHIE


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